中华人民共和国农业行业标准
ny/t 2640-2014
植物源性食品中花青素的测定
高效液相色谱法
determination of anthocyanidins in plant origin products-
high performance liquid chromatography
1范围
本标准规定了植物源性食品中的飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素共6种花青素的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于植物源性食品中花青素含量的测定。
本标准的检出限：以称样量为1 g，定容体积为50 ml计，飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素5种花青素的检出限均为0.15mg/kg；矮牵牛色素的检出限为0.5mg/kg。同样条件下定量限：飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素5种花青素均为0.5mg/kg；矮牵牛色素为1.5mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可（ke）少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
gb/t 6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义
gb/t 6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
gb/ t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
植物源性食品中的花青素主要以花色苷的形式存在。试样经乙醇-水的强酸溶液超声提取花色苷后，经沸水浴将花色苷水解成花青素，用高效液相色谱法测定，以保留时间定性，外标法定量。
4试剂和材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为gb/ t 6682规定的一级水。
4.1无水乙醇(c2h5oh)：色谱纯。
4.2甲酸(ch2o2)：色谱纯。
4.3甲醇(ch3oh)：色谱纯。
4.4盐酸(hcl)：优级纯。
4.5提取液：无水乙醇+水+盐酸= 2+1+1(v+ v+v)，取200 ml无水乙醇、100 ml水和100 ml盐酸混匀。
4.6 10%盐酸甲醇溶液(体积比)：取10ml盐酸、90ml甲醇混匀。
4.7飞燕草色素(delphinidin)：cas号528-53-0，纯度≥96%。
4.8矢车菊色素(cyanidin)：cas号528-58-5，纯度≥98%。
4.9矮牵牛色素(petunidin chloride)：cas号1429-30-7，纯度≥96%。
4.10天竺葵色素(pelargonidin)：cas号134 -04-3，纯度≥96%。
4.11芍药素(peonidin)：cas号134-01-0，纯度≥98%。
4.12锦葵色素(malvidin)：cas号643-84-5，纯度≥96%.
4.13单标储备溶液
分别准确称取飞燕草色素(delphinidin)、矢车菊色素(cyanidin)、矮牵牛色素(petunidin chloride)、天竺葵色素(pelargonidin)、芍药素(peonidin)和锦葵色素(malvidin)共6种花青素标准品5.0mg，用10%盐酸甲醇溶液(4.6)溶解并分别定容至10ml容量瓶中，即为500mg/l的单标储备液，于-18℃下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中，保存有效期为6个月。
4.14混合标准使用液
在使用中将单-标准储备液进行混合后，用10%盐酸甲醇溶液(4.6)作为溶剂，并逐级稀释成0.5mg/l、1.0 mg/l、5.0 mg/l、25.0 mg/ l、50.0 mg/ l或其他浓度的花青素混合标准使用液。在4℃条件下，有效期为6个月。
4. 15滤膜：0.45μm，水相滤膜。
5仪器与设备
5.1高效液相色谱仪带
紫外或二极管阵列检测器。
5.2天平：精度0.01 mg，0.01 g。
5.3水浴锅：精度±2℃。
5.4匀浆机。
5.5超声波清洗机。
5.6粉碎机。
6分析步骤
6.1试样制备
采用四分法分取样品，含水率高的样品，如葡萄茄子等，取约200g于匀浆机中匀浆；含水率低的样品，如黑米、黑豆等，用粉碎机进行粉碎，过250μm的筛。所有样品在-18℃条件下保存。
6.2提取
根据样品中花青素含量，称取样品1.00g~10.00g于50 ml具塞比色管中，加入提取液(4.5)定容至刻度，摇匀1min后，超声提取30min。
6.3水解
超声提取后，于沸水浴中水解1 h，取出冷却后，用提取液(4.5)再次定容。静置，取上清液，用0.45μm水相滤膜过滤，待测。样品制备好后，在4℃条件下，保存时间不超过3 d。
6.4测定
6.4.1色谱参考条件
a)色谱柱：c18柱，250 mm×4. 6mm×5μm或性能相当者；
b)流动相a为含1%甲酸水溶液，流动相b为含1%甲酸乙腈溶液；
c)检测波长：530 nm；
d)柱温：35℃；
e)进样量：20μl；
f)梯度洗脱条件，见表1。
6.4.2色谱分析
分别将标准溶液和试样溶液，注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。色谱图参见附录a。
7结果计算
样品中花青素含量为6种花青素含量之和。其含量以质量分数ω计，单位为毫克每千克(mg/kg)，按式(1)计算。
式中：
ρ——待测液中各花青素的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
v——定容体积，单位为毫升(ml)；
m——试样质量，单位为克(g)。
测定结果取两次测定的算术平均值，计算结果保留三位有效数字。
8精密度
本标准精密度数据是按照gb/t 6379.1和gb/t6379.2的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以95%的置信度来计算。本标准方法的精密度数据参见附录b。