可能原因1：引物问题（包括：引物设计较差，引物合成较差，引物浓度太低）。解决方法：设计引物的时候，避免在引物3'端含有互补序列；避免可以形成内部发卡结构的序列；设计tm类似的引物。针对引物合成的问题，用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于0.1μm到0.5μm之间。可能原因2：探针问题。解决办法：就要用到我们前面提到的序列分析了。用blast对探针序列进行比对，设计符合要求的探针。可能原因3：模板问题（包括：模板质量不好，模板浓度太低）。解决方法：提高模板质量。如果怀疑模板被dmso等抑制剂污染了，坚决采用乙醇沉淀；使用104copy的靶序列，然后在25到30个循环中获得信号。可能原因4：不明物干扰。解决办法：做rt-pcr必须非常小心翼翼。对rt-pcr的任何实验样品或试剂，均应采用“三无”离心管（即无菌无酶无热源）进行试剂的分装和使用。可能原因5：扩增酶问题。解决办法：不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。推荐：选择hot starttaq酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素。
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