2013年，哈佛医学院的研究人员曾在《nature review genetics》杂志上发表了一篇很有意思的综述，讨论了新一代测序（ngs）实验中错误的来源1。文章指出，在样品制备和文库制备环节，用户操作失误（user error）都是常有的事，比如贴错标签或者加错溶液。
然而，测序毕竟不同于核酸纯化，后者失败了大不了重做。对测序而言，一个简单的移液或混合错误有可能让你付出高昂的代价。无论老板是否nice，测序实验从头再来的感受肯定不佳，实验室需要耗费大量的时间和成本，况且有些样本还很稀有。不过，每次要处理那么多的样本，即使打起十二分精神，还是难保不出错。
为了避免操作失误的发生，赛默飞想到了一个绝妙的好办法。invitrogen collibri系列文库制备试剂盒中的每种试剂都带有一种示踪染料，便于人们清晰观察文库制备过程。若你看到溶液均匀变色（比如从蓝色变为绿色，图1），则可以确信相关试剂已添加且*混匀。若是漏加了某种试剂，或者没有混合均匀，则观察不到预期的颜色变化。
图1. collibri ps dna文库制备试剂盒的颜色变化
不用担心，试剂中的惰性染料既不会干扰酶促反应，也不会影响测序结果。后纯化所得的文库是澄清透明的。这种实时的颜色变化提示，让操作失误的可能性大大降低，也让你对文库制备的过程充满信心。
看到这里，你一定想知道，collibri系列文库制备试剂盒包含哪些产品，适合哪些应用？其实，针对全基因组测序和转录组测序，此系列都有相应的试剂盒提供，均适用于illumina的高通量测序仪。下面就让小编来一一介绍。
全基因组测序
▪collibri ps dna文库制备试剂盒适用于物理片段化的基因组，支持1-1,000 ng的样本起始量
▪collibri pcr-free ps dna文库制备试剂盒同样适用于物理片段化的基因组，采用pcr-free的实验方案，支持500-1,000 ng的样本起始量
▪collibri es dna文库制备试剂盒适用于酶法片段化的基因组，支持1-500 ng的样本起始量
▪collibri pcr-free es dna文库制备试剂盒同样支持酶法片段化的基因组，采用pcr-free的实验方案，支持100-500 ng的样本起始量
根据片段化方式的不同，collibri dna文库制备试剂盒可分为两大类：物理片段化（ps）和酶法片段化（es）。物理方法片段化主要是利用机械破碎的方法将基因组随机打断，如超声破碎、雾化等。酶学方法片段化主要利用酶的剪切功能将基因组片段化。酶法片段化方式操作简单，但物理片段化方式的片段随机性更好。此外，每种试剂盒都有pcr扩增产品和pcr-free产品可选。
与同类产品相比，collibri系列文库制备试剂盒能够在更短时间内完成建库。以collibri pcr-free ps dna文库制备试剂盒为例，文库制备可在1.5小时内完成，而整个实验流程的总时间缩短至6.5小时。其他产品一般需要7小时以上，甚至超过10小时。
若起始材料有限，可以选择pcr方案。不管是pcr-free文库还是经pcr扩增的文库，都可以始终保持均一的gc覆盖度，将gc bias降至低。即使是“测序困难户”，如bad promoters或gc含量高达75%的区域，覆盖度也优于同类产品，包括ffpe样本。这种高覆盖度使得突变检测的灵敏度和准确度得到增强。
经过实验证实，collibri dna文库制备试剂盒能够地检测新生突变（de novo mutations）。不管是pcr方案还是pcr-free方案，它们都能够检测snp，对于10 ng及以上的起始dna样本量，collibri ps dna文库制备试剂盒的snp recall高于98.8%（图2）。此外，即使是低起始量样本，插入突变检测的indel recall也高于同类产品。
collibri dna文库制备试剂盒包含了wgs文库构建所需的所有组分，除了核心酶组分以外，还包括磁珠及经特殊设计的indexed adaptors，无需再单独购买。试剂盒随附提供*双端index（udi）。与传统的cdi相比，udi的使用大大降低了标签串扰（index hopping）的比例。
图2. 检测突变
全转录组测序
collibri rna测序建库流程不同于市面上一般的rna-seq建库流程。rna经酶片段化后直接与adaptor（含有辅助oligo）连接，之后逆转录形成cdna，后再通过pcr扩增引入index（图3）。
这种*的建库流程可保留样本的复杂度，适用于不同质量的样本类型，如完整rna、降解rna、ffpe样本等。使用统一引物进行cdna合成，不会受gc含量的影响，且无需引入随机oligo序列，避免检测snp或点突变时出现假阳性。
图3. collibri rna测序建库流程
collibr™ stranded rna文库制备试剂盒同样能够实现快速建库。包括rrna去除在内，转录组文库构建可在6.5小时内完成。这样使得从rna提取到文库构建完成的总时间缩短至10.5小时左右。
可选的collibri h/m/r rrna depletion kit还能从100-1000 ng人、小鼠或大鼠总rna中去除rrna。与市面上其它rrna去除方法不同，这种试剂盒基于亲和探针杂交和磁珠纯化方法，可特异地去除rrna序列。探针的数量和靶向位置均经精心设计，可以去除28s、18s、5.8s、45s、5s、mt16s和mt12s核糖体序列。
collibri rna文库制备试剂盒内包含rna-seq文库构建所需的所有组分，除了片段化酶、rna末端修饰试剂、adaptor、连接酶、反转录试剂、文库扩增试剂外，还包含rrna去除试剂、纯化磁珠以及index primer等。
文库定量
基于qpcr的collibri文库定量试剂盒能够对文库有效浓度进行准确定量，适合大批量样本的文库定量。该试剂盒包含collibri文库定量预混液、collibri dna标准品和collibri文库稀释缓冲液。在文库定量时，使用一组6个预先稀释的dna参考标准品来生成标准曲线，通过这一标准曲线可测定样本文库浓度。
基于invitrogen™ platinum™ ii taq 热启动dna聚合酶的qpcr预混液含有靶向illumina p5和p7 adaptor序列的引物。platinum ii taq 热启动dna聚合酶可以均匀扩增gc含量不同和长短各异的dna片段，因此是定量测序文库的理想选择。
与荧光检测方法相比，qpcr检测近测定含有p5和p7 adaptor的文库片段，因此能够更加特异和准确地检测ngs测序文库。collibri检测十分灵敏，可以定量飞摩尔量级的片段文库。起始量要求极低，通常仅需4 μl稀释的文库样本，浓度>0.0002 pm即可。同样，颜色指示可降低反应配制期间移液错误的风险。