细菌膜蛋白质微量提取试剂盒使用方法
准备：第一次使用本试剂盒时需要将所有 dnase i 干粉倒入溶液 b 中，轻柔颠倒 使 dnase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则 dnase 将逐渐失去活性。此外，最好在实验前 1 小时将溶液 b 冰浴预冷。
用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的 sds-page 电泳等实验）
1、 收集 20-40 ml 过夜培养的细菌饱和培养液（od420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
2、 加入 2 ml 溶液 a，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 a 中。
3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。 4、 加入 0.5 ml 溶液 b（必须已经提前加入了 dnase i 干粉），轻柔吹打使细菌 重悬。注：如果细菌起始量没有 20-40 ml，溶液 a 的用量可以等比例降低。 重悬在溶液 a 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、 用超声或 french press 方法裂解细胞。如果用 french press 方法，则需要 处理至少两次，每次的压力为 9.65×10e7（=14000 psi）。注意：不论用哪 种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌 裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。
6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 ml-15 ml 塑料离心管中 （如 beckman optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。
7、 在上清（细菌裂解液）中加入 5 ml 预冷的溶液 c，轻柔颠倒混匀后冰浴放置 30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。
8、 用 bechman optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以 使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 0.2 ml 溶液 a，充分吹打混匀。
10、用 beckman optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可 以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。 11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入 0.1 ml 自备的， 跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×sds-page 上样液中，可从本公司购买）， 所得膜蛋白的浓度将在 1mg/ml 左右。
用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的 2d 电泳等实验）
1、 收集 200-400 ml 过夜培养的细菌饱和培养液（od420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
2、 加入 20 ml 溶液 a，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 a 中。
3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
4、 加入 5 ml 溶液 b（必须已经提前加入了 dnase i 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 200-400 ml，溶液 a 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 a 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、 用超声或 french press 方法裂解细胞。如果用 french press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65×10e7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。
6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀（未破裂细胞）。
7、 在上清（细菌裂解液）中加入 50 ml 预冷的溶液 c，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以zui低速度搅拌。
8、 用 beckman type 55.2 ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 2 ml 溶液 a，充分吹打混匀。
10、用 beckman type 55.2 ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 ml 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×等电点电泳上样液，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度在 1mg/ml 左右。
关键词：显微镜 超速离心机 离心机