非洲猪瘟病毒荧光定量 pcr 试剂盒使用方法
一、样品 dna 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 dna，本试剂盒跟市场上大多数病毒 dna 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 dnaout 或其升级版柱式病毒 dnaout。
二、稀释阳性对照（以 10e2-10e7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，
因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成
分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染xing病原，本产品不提供活体样品做阳性对照， 只提供可以直接使用的 dna 片段作为阳性对照。
非洲猪瘟病毒荧光定量 pcr 试剂盒(染料法) asfc qpcr kit（dye based） cat#:14-23000
2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μl 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μl 1×10e8 拷贝/μl 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10e7 拷贝/μl 的阳性对照。放冰上待用。
5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μl 1×10e7 拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10e6 拷贝/μl 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μl 1×10e6 拷贝/μl 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10e5 拷贝/μl 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μl 1×10e5 拷贝/μl 的阳性对照到 4 号管中，得 1×10e4 拷贝/μl 的阳性对照。放冰上待用。
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。三、设置 qpcr 反应（20 μl 体系，在样品制备室进行）
9.在 pcr 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管
和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：
成分 样品 阴性对照 阳性对照（2-7 管）
2×qpcr magicmix 10 μl 10 μl 各 10 μl
引物混合物 2 μl 2 μl 各 2 μl自备 10×rox (见注) 2 μl 2 μl 各 2 μl
待测样品 dna 模板 6 μl 不加 不加
各 6μl（2 号样到阳性对照（2-7 号） 不加 不加 2 号管，3 号样到 3
号管…）
注:仅 abi7500、7700 和 7900 仪器需要使用rox 作为对照，其他荧光 pcr 仪器（如 icycler iq、mj option、mj chromo4、mx3000、mx4000、rotorgene 3000、rotorgene 6000 和 lightcycler480）不需要使用 rox，则用水替代。
10.盖上盖子后上机，按下面参数进行 pcr（具体 pcr 参数可以根据仪器不同而自行
优化）。
过程 温度 时间
预变性 94℃ 5 分钟
pcr 反应
（30 个循环） 94℃ 60 秒
50℃ 60 秒
72℃ 60 秒
11.数据采集
具体操作按所用仪器*的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 dna 时， 大吸收光谱在 471 nm，结合 dna 时的大吸收光谱在 500 nm，大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
12.以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品
的 ct 值从标准曲线上推算出样品 dna 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
产品保存 低温运输，-20℃保存