引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发dna聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：
1、引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于taq dna聚合酶进行反应。
2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如ggg或ccc，也会使错误引发机率增加[2]。
3、引物3’端的末位碱基对taq酶的dna合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为a的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基a[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致pcr反应失败。5’端序列对pcr影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4、引物序列的gc含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的gc含量不能相差太大。
5、引物所对应模板位置序列的tm值在72℃左右可使复性条件最佳。tm值的计算有多种方法，如按公式tm＝4(g+c)＋2(a+t)，在oligo软件中使用的是最邻近法(the nearestneighbor method)。
6、 ?g值是指dna双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?g值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?g值相对较高的引物。引物的3’端的?g值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发dna聚合反应[6]。
7、引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使pcr反应不能正常进行[8]。
8、对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入pcr产物的载体的相应序列而确定。