研究表明，内皮-间充质转化（endomt）参与病理性血管重塑过程。作为内皮细胞的前体细胞，内皮祖细胞（epcs）endomt也是病理性血管重塑的常见机制。此外，振荡剪切应力（oss）促进了epc endomt。epcs暴露于oss后，内皮细胞标志物ve-钙粘蛋白和cd31的表达下调。同时，间充质细胞标志物α-sma和sm22α的表达显著增加。因此，潍坊医学院基础医学院、淄博市中心医院转化医学中心的一项研究探讨了oss诱导的epc endomt的机制，以期进一步阐明oss对epc endomt的影响以及病理性血管重塑的发生和发展。
外泌体（exos）是具有完整膜结构（直径30-150nm）的纳米级细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。exos被认为是细胞-细胞通讯的重要介质，参与许多生理和病理过程。在这项研究中，研究人员发现oss处理的epcs释放的exos（oss-exos）可以诱导epc endomt。但内部机制有待进一步探讨。
最近，exos中的环形rnas（circrnas）引起了广泛的关注。circrnas具有共价闭环结构。新出现的证据表明，外泌体circrnas在复杂的人类病理学中起着重要作用。此外，circrnas可以充当mirna分子的“海绵”，抑制mirna与靶基因mrnas的结合，从而促进靶基因的转录。
该团队使用高通量测序技术研究了暴露于oss的epcs中circrnas的表达谱。基于生物信息学分析和实验验证，发现circ-1199被oss显著上调并明显加载到exos中。然而，oss诱导的epc endomt是否由外泌体circ-1199介导目前尚不清楚。该研究旨在探讨 exos 和外泌体circ-1199对epc endomt的影响和可能机制。
从 oss 处理的 epcs 灌流液中分离的exos诱导 epc endomt
epcs分泌的exos影响血管细胞和组织功能，实验首先确定了exos是否参与oss（±3.5 dyne/cm2，1 hz）诱导的epc endomt。从细胞上清液（static-exos）或灌流液（oss-exos）中分离exos。wb揭示了epcs衍生的exos表达cd9、cd81和cd63，它们是exos的代表标志物。
为了评估oss-exos对epc的影响，pkh26标记的exos与epcs的共培养，发现这些exos被epcs有效地吸收（图1 d）。edu测定结果表明，oss-exos显著增加了epcs的增殖（图1 e）。rt-qpcr和wb结果显示，oss-exos下调内皮标志物cd31和ve-钙粘蛋白的表达，上调间充质细胞标志物α-sma和sm22α的表达（图1 f、g）。这些数据表明，oss-exos在epcs中诱导了endomt。
图1 oss-exos诱导epc增殖和endomt。
circ-1199 在用 oss 和 oss-exos 处理的 epcs 中显著上调
通过高通量rna测序筛选用oss处理的epcs中表达的circrnas。如图2 a-b所示，基于生物信息学分析，选择circ-1199作为靶向circrna。接下来，通过rt-qpcr证实了circ-1199在oss 加载的epcs中的表达。结果表明，当epcs加载oss持续 3、6、12、24 h时，circ-1199在6 h后增加，并在24 h内保持较高水平（图2 c）。此外，rna fish表明epcs在静态状态下很少表达circ-1199，但在oss加载后circ-1199阳性细胞数量明显增加（图2 d）。
接下来，进行rt-qpcr和rna fish测定以测量exos中circ-1199的表达。rt-qpcr结果显示，oss-exos中circ-1199的水平高于静态-exos（图2 e）。rna fish结果表明，当exos与epcs共培养时，oss-exos处理的epcs中circ-1199的表达高于静态-exos处理的epcs（图2 f）。
图2 circ-1199在用oss处理的epc中异常表达。
circ-1199 促进了 epc endomt
为了评估circ-1199对epc endomt的影响，将circ-1199过表达慢病毒载体（lv-circ-1199）转染到epcs中。结果表明，用lv-circ-1199转染epcs后，circ-1199的表达明显上调，增殖明显增加。此外，内皮细胞标志物ve-钙粘蛋白和cd31的表达降低，而间充质标志物α-sma和sm22α的表达在基因和蛋白质水平均上调。这些结果与用oss-exos处理的epcs的结果一致。
circ-1199–let-7g-5p–hmga2 cerna 参与 epc endomt
新兴研究表明，circrnas的主要机制是作为mirna的海绵，从而释放mirnas对靶基因的抑制作用。然后，实验预测了mirnas和circrnas之间的结合位点。结果表明，circ-1199具有两种类型的mirnas（mir-520f和let-7g-5p）的结合位点，let-7g-5p表现出更多的结合位点。同时，获得了94个靶基因作为let-7g-5p候选基因，其中hmga2得分最高。双荧光素酶报告基因测定显示，circ-1199有效结合let-7g-5p（图3 c），let-7g-5p也与hmga2 mrna的3′utr结合（图3 d）。rt-qpcr结果表明，circ-1199的过表达降低了let-7g-5p的表达，同时增加了hmga2的表达（图3 e）。此外，let-7g-5p模拟物（图3 f）和lv-shhmga2（图3 g）都下调了epcs中α-sma和sm22α的表达。
有趣的是，用oss-exos处理epcs后，circ-1199的表达增加（图3 h）。同时，let-7g-5p的表达降低（图3 i），hmga2显著增加（图3 j）。wb结果证实了hmga2的上调表达（图3 k）。
这些结果表明，oss-exos可以上调circ-1199，从而可能发挥分子“海绵”的作用吸附let-7g-5p，从而增加hmga2的表达。
图3 circ-1199–let-7g-5p–hmga2 cerna参与epc endomt。
circ-1199–let-7g-5p–hmga2 调节 epc 转录因子 smad3 和 snail
据报道，多种信号通路，如tgf-β/smad信号、wnt/β-连环蛋白信号和notch信号通路，都参与了endomt的转录调控。研究表明，hmga2上调tgf-β/smad信号通路中snail、twist 和slug 的表达，从而导致上皮细胞中上皮到间充质的转化（emt）。因此，实验进一步研究了转录因子smad3和snail是否参与epcs的endomt过程。wb结果表明，oss-exos处理epcs后，p-smad3/smad3和snail的蛋白表达明显上调。
为了进一步了解oss-exos激活epcs中endomt相关转录因子的机制，在用lv-circ-1199，let-7g-5p模拟物或lv-shhmga2预处理epcs后测量了hmga2，p-smad3 / smad3和snail的表达。结果表明，经lv-circ-1199、let-7g-5p模拟物和lv-shhmga2处理后，hmga2、p-smad3/smad3和snail 的表达均上调。然而，let-7g-5p模拟物和lv-shhmga2抑制了epcs中hmga2，p-smad3/smad3和snail的表达。
这些结果表明，circ-1199–let-7g-5p–hmga2参与了epcs中oss-exos诱导的p-smad3/smad3和 snail 的激活。
oss-exos 和 circ-1199 在体外和体内都损伤了 epcs 的血管生成
血管生成能力是epcs的重要功能。血管生成能力下降是 epc s中 endomt 之后的标志性事件。为了进一步研究oss-exos对epc功能的影响，实验在体外评估了血管生成。结果表明，oss-exos组epc血管生成显著降低（图4 a）。此外，用lv-circ-1199转染后，epcs的血管生成能力也明显降低（图4 b）。
接下来，使用matrigel plug 测定法来测定小鼠体内epcs的血管生成。结果表明，用oss-exos处理的epcs形成较少的血管样结构（图4 c）。此外，在oss-exos处理的epcs中，cd31和vwf的表达降低（图4 d），α-sma和sm22α的表达增加（图4 e）。
此外，与对照组相比，用lv-circ-1199处理epcs后，血管状结构的数量减少（图4 f）。同时，内皮标志物cd31和vwf的表达降低（图4 g），但间充质标志物α-sma和sm22α的表达明显增加（图4 h）。
图4 oss-exos和circ-1199在体外和体内都损害了epcs的血管生成。
图5 在exos circ-1199处理后 epc endomt的机制。
综上所述，在oss-exos中富集的circ-1199促进epc endomt并作为let-7g-5p的分子海绵，从而上调hmga2的表达。然后p-smad3/smad3/snail 可能参与这个过程（图5）。
参考文献：li l, wen j, li h, he y, cui x, zhang x, guan x, li z, cheng m. exosomal circ-1199 derived from epcs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of epcs by increasing hmga2 expression. life sci. 2023 jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. epub 2022 nov 23. pmid: 36435223.