组织线粒体分离试剂盒的应用及使用方法！
一、背景
组织线粒体分离试剂盒可用于快速便捷分离组织/细胞线粒体，获得的线粒体纯度较高，且绝大部分都含有完整的内膜和外膜，可用于线粒体的生理功能等方面的研究，得到的线粒体也可被相应裂解液裂解得到线粒体蛋白，从而用于后续sds-page、western、双向电泳及免疫共沉淀等分析。
线粒体是绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器，是细胞的动力工厂，细胞进行氧化磷酸化的场所。因此，对线粒体进行分离，以此为对象，对线粒体呼吸作用、mtdna、mtrna以及其他线粒体蛋白性能分析等具有重要意义。
二、组织线粒体分离试剂盒使用方法
1、线粒体的抽提
1）样本处理
①组织匀浆：称取100-200mg新鲜组织，pbs或生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，用剪刀剪成非常小的碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1-2.5ml冰预冷的试剂a，混匀，孵育8-10min，匀浆10-30下左右，也可采用超声方法破膜。
②培养细胞匀浆：消化细胞，pbs洗涤，800 g离心5-10 min收集细胞。计数，每次提取需要1-5×107个细胞，加入1-2.5ml预冷的试剂a，重悬细胞，混匀，孵育8-10min，可以采用超声或匀浆器方法破膜。
2）将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，800 g离心5 min。
【注】：细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等沉淀在管底。
3）收集上清液并转移到新的离心管。4 ℃，800 g再次离心5 min。弃沉淀。
4）将上清液转移到新的离心管。4℃，12,000×g离心10 min，小心去除上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
【注】：离心后的上清含胞浆成分，尽量除去上清。
2、线粒体蛋白的抽提
1）向每毫升预冷试剂b加入10μl试剂c混匀。冰上保存数分钟待用。
2）按每10μl线粒体压积中，加入100μl上述配制好的试剂b/c溶液。
3）置于4℃旋涡振荡15-30 min。
4）10,000rpm，4℃离心15min，取上清，即为线粒体全蛋白提取物，进行蛋白定量。
5）分装保存于-70℃，避免反复冻融。
三、应用
组织线粒体分离试剂盒可以用于猪pgc-1α、线粒体相关基因组织表达及leptin对pgc-1α、ucps mrna表达的影响：
线粒体是细胞内重要的亚细胞器,普遍存在于真核细胞中,其通过呼吸作用将糖、蛋白、脂类等生物大分子物质氧化分解,释放atp,为机体提供能量。目前研究表明,线粒体不仅与能量代谢密切相关,而且其也是影响肉质嫩度及风味的一个重要因素没,本研究以猪为实验动物：
(1)利用rt-pcr方法分析线粒体相关基因pgc-1α、ucp2、ucp3、cyt-c、cpt-ⅰ组织差异表达特点;
(2)建立了猪骨骼肌卫星细胞的分离培养体系;(3)研究外源leptin对猪成肌细胞中pgc-1α、ucps mrna表达的影响。
结论：
1、pgc-1α基因进行组织分布研究发现:心脏、肝脏、肌肉、肺脏、肾脏、脾脏、皮下脂肪和内脏脂肪中均有的pgc-1αmrna表达,其中心脏、肝脏、肌肉的表达丰度,ucp2基因在、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪中均有表达,在心脏、肺中没有检测到表达,其中肾脏表达丰度,在肌肉中次之,肝脏中的表达量。而内脏脂肪和皮下脂肪中ucp2基因mrna表达丰度差异不显著。ucp3基因在肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪中均有表达,在其他几个组织中均没有检测到表达,肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪ucp3基因mrna表达丰度差异不显著。cyt-c基因在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中心脏中表达,肝脏、肌肉表达次之。cpt-ⅰ基因mrna在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中肝脏中表达,心脏、肾脏、脾脏镖达次之,而皮下脂肪的表达量高于肌肉(p<0.05)。
2、用链酶蛋白酶、胰酶、胶原酶分别消化骨骼肌组织块,结果表明,链酶蛋白酶消化所获得的肌卫星细胞数显著高于胰酶和胶原酶。在一定的消化时间内,胶原酶消化的效果较差,消化物中含大量的肌束,所获得肌卫星细胞数量很少。三种酶消化所得细胞活率无显著差异。用desmin抗体及abc染液进行间接免疫酶染色,rt-pcr方法检测myog和myod的表达,结果显示链酶蛋白酶消化所得肌卫星细胞95%呈阳性反应,培养7天后myog和myod均有表达,说明分离得到是肌卫星细胞。
3、半定量rt-pcr分析结果表明,30和100 nmol/l的leptin均可促进pgc-1a转录,100 nmol/l leptin处理12 h后可促进pgc-1αmrna表达;处理24 h后,pgc-1αmrna水平显著高于对照组(p<0.05)。30 nmol/l处理24 h后可提高pgc-1αmrna水平,但其促进效果明显低于100 nmol/l处理组(p<0.05)。半定量rt-pcr分析结果表明,30 nmol/l leptin可明显提高成肌细胞中ucp2mrna的表达,处理12和24 h后ucp2mrna水平显著高于对照组,且作用24 h促进效果明显优于12 h处理效果(p<0.05),100 nmol/l leptin提高成肌细胞中ucp2mrna的表达,处理12和24 h后ucp2mrna水平显著高于对照组,但作用低于12和24 h后30 nmol/l leptin作用效果(p<0.05)。30和100 nmol/l leptin在时间上和剂量上,均不影响ucp3mrna水平表达水平(p<0.05)。
综上所述,线粒体相关基因表达存在明显的组织差异性,pgc-1a在富含线粒体的组织中表达较高,表明其与线粒体发育存在明显相关。其它基因根据组织能量需求及代谢特点不同而表达有所差异。外源添加不同浓度的leptin显著影响pgc-1α和ucp表达,提示leptin可通过调控线粒体而影响机体能量代谢。