肠杆菌科及实验室检验方法！
中国微生物菌种查询网：目前在世界各地广泛采用大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌作为食品卫生指标菌，但在欧洲还大量使用肠杆菌科（enterobacteriaceae）作为指标菌并且已有多年历史。肠杆菌科小组委员会（1962）、bergey氏分类系统细菌学手册（1984）和w、h ewing氏著《肠杆菌科鉴定》（1986）一书中均将肠杆菌科定义为：革兰氏阴性无芽胞杆菌，需氧、兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵利用葡萄糖产酸或产酸、产气，氧化酶阴性。据细菌学新的分类，肠杆菌科现已包括肠道病原性和非病原性的艾希氏、志贺氏、爱德华氏、沙门氏、亚利桑那、枸橼酸杆菌、克雷伯氏、肠杆菌、团聚肠杆菌、哈夫尼亚、沙雷氏、变形杆菌、耶尔森氏、欧文氏14个菌属及其他9个菌群的细菌。故以其作为指标菌则较大肠菌群等指标菌更敏感，更准确。
一、肠杆菌科作为指标菌的卫生学意义
早在19世纪50年代，欧洲公共卫生细菌学家德国的seeliger氏和挪威的henrcksen氏便*并采用以在分类学上准确描述命名的肠杆菌科来代替无分类学名称的大肠菌群、粪大肠菌群作为食品卫生指标菌。其优点为可消除因大肠菌群、粪大肠菌群产气特性随检验方法和实验条件不同而造成结果的不准确性；检出肠杆菌科可以认为加工后产品再次污染细菌，因此大大提高了以大肠菌群或粪大肠菌群试验来证明食品加工不当的敏感性。若食品中肠杆菌科的计数超过一定*，则表明在加工过程中存在着一个或多个缺陷。如不适当的加工工艺、后加工的再污染、储存的温度不当等。在乳品工业中采用肠杆菌科作为指标菌则有着更重要的公共卫生学意义。如在生产奶酪时，若使用未经巴氏消毒的牛奶，因生奶在农场或转运冷藏期间肠杆菌科中的嗜冷性细菌如蜂房哈夫尼亚菌和沙雷氏菌可生长且分解蛋白质和脂肪，促使奶酪成熟并产生香味。但当生奶冷藏时间过长，这些菌生长繁殖达到很高的数量，则会使生奶产生异味并变质。所以控制一定数量的肠杆菌科细菌对设计有效的冷藏期限和对加工工艺的评价有很大的价值。此外，生奶中的产气肠杆菌和大肠艾希氏菌能发酵乳糖产生大量气体，可引起奶酪产生大量气孔。奶酪早期气孔的产生及肠杆菌科的水平和种类均可预示着有潜在的危险。尚有在肉类及海产品中较高水平的肠杆菌科中的嗜冷、分解脂肪和蛋白质的细菌可使其变质、发生酸败。因此，检测这类细菌与细菌总数的比例对某些食品是极其有用的质量指标。
二、各国对食品中肠杆菌科的*
肠杆菌科作为指标菌尚未在世界范围内通用，*于欧洲。其对食品中肠杆菌科的要求*列于下表。
种类
要求*/g
来源
瑞士
已加工的制品：
⒈加热的整块肉制品、带或不带盐，如碎腊肠、烧鸡等⒉加热的切割肉制品
⒊已烹调好的香肠：血肠、碎肝肠、冷肉糜、碗装汤
肝肠
半成品和食品调料：
⒈煎肠肉汤
⒉生碎肉制品
⒊剁碎肉
⒋血浆
⒌烧肉皮或肉皮块
⒍加工肉，包括熏肉和经权力机构批准的加工肉制品
102
103
102
103
105
５×10４
10４
103
10５
５×106
瑞士联邦医局 1981.12.1
西班牙
双壳贝类：
⒈鲜活品、腌渍品、冷冻品
⒉咸干、腌制、干制品
⒊醋渍品
１×103
１×103
１×102
西班牙卫生部1 9 9 3 . 10 . 2 9
荷兰
宠物饲料（包括狗咬胶）
ｎ＝５，ｃ＝２，ｍ＝１０，ｍ＝３×１02
国检监
（１９９５）３５０号
英国
三、食品中肠杆菌科检验方法
肠杆菌科作为食品卫生指标菌在欧洲已有多年历史，对其检验方法不少学者曾进行了研究。目前北欧食品分析委员会（nmkl）及iso已制定了食品中肠杆菌科检验的标准方法。包括了直接增菌和前增菌的定性方法；菌落计数和带恢复的mpn定量方法。近年来，随着对外贸易的发展，欧洲一些已对我国出口的某些食品和动物饲料提出了检测和*。且将其作为间食品微生物学实验室质量控制、水平测试的必测项目之一。我国大多数食品卫生检验人员对该项指标和检验方法缺乏了解，为适应外贸发展需要，原天津、辽宁商检局的技术人员，采用标准菌株和自然食品样品参照国外现有标准方法进行了研究，制定了《出口食品中肠杆菌科检验方法》行业标准。该行业标准有如下特点：
1、制定了两种定量检验方法，可根据对各种食品规定的不同*或加工方式进行选择。菌落计数法适用于检查未经加工处理的生鲜食品或肠杆菌科计数*>100/g的加工食品，带恢复的mpn法适用于肠杆菌科计数≤100/g的加工食品。
2、采用了亚致死性损伤菌恢复步骤并成功地应用于mpn定量法中，对冷冻产品，加热冷冻产品采用36±1℃4h恢复，对加热干燥等处理过的食品需用36±1℃18－24h恢复。
3、将国外现有标准方法中ee肉汤作了改良，即将原配方中的胆汁含量由20g/l降至10g/l。大大降低了对肠杆菌科细菌的抑制力，提高了方法的灵敏度和检出率。
4、对在分离培养基vrbga上经36±1℃培养24h后，菌落直径仍<0.5mm的肠杆菌科。如奇异变形杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等延长培养时间至48h，弥补了国外现有方法中仅在vrbga 36±1℃培养24h后，挑选菌落直径>0.5mm的肠杆菌科菌落可造成漏检之不足。
5、nmkl法仅以氧化酶阴性、iso方法以氧化酶阴性和葡萄糖琼脂呈黄色为阳性对肠杆菌科进行确认。前法可将不发酵葡萄糖，但可利用蛋白胨生长、氧化酶也为阴性的沃夫氏不动杆菌误判为肠杆菌科，造成假阳性结果，使计数结果偏高；后法则易将葡萄糖琼脂表面变为蓝色的阴沟肠杆菌，产气肠杆菌和沙雷氏菌漏检，出现假阴性，使计数结果偏低。本行业标准采用了氧化酶阴性，葡萄糖琼脂发酵为全黄或黄色底层、蓝色斜面，产气或不产气作为判定标准才可对肠杆菌科进行准确的确认。
6、方法的灵敏度
⑴菌落计数法的灵敏度为≥10/g
⑵带恢复的mpn法的灵敏度为≤10/g或<100/g
四、食品中肠杆菌科的污染情况
mossel氏等曾对103份干蛋粉、22份椰子粉和44份动物饲料共计169份样品进行了肠杆菌科污染情况的调查，其检出率分别为80%、95%和84%。pitargaya氏等对采集于13个农场的39份鲜羊奶和采集于乳品店的120份当日羊奶的检样进行了肠杆菌科及其它相关菌的调研，发现鲜羊奶中的肠杆菌科/ml的几何平均计数为4.4×102，当日羊奶为6.2×103。
原天津商检局曾对四种食品100份样品进行了调查，结果为：从四种食品中共检出了肠杆菌科细菌阳性样品63份，阳性检出率为63％，但依食品种类而异，以冻鱼片检出率zuigao，为83.3%。脱脂淡奶粉检出率zuidi，为30.0％。在63份阳性样品中，肠杆菌科计数>103/g的试样14份。占22.2％；计数<108/g的试样49份，占77.8％。其中，冻鱼片为16份，占该食品阳性样品的64.0％；速冻方便食品为15份，占该食品阳性样品的83.3％；脱水白萝卜丝为15份，占该食品阳性样品的88.2％；脱脂淡奶粉的３份阳性样品的肠杆菌科计数均＜108/g。
从四种食品中共分离出肠杆菌科中九个菌属的十五种细菌，占肠杆菌科常见的十四个菌属的64.3％，另分离出其它菌群中的团聚肠杆菌。除脱脂淡奶粉外，从其它三种食品中均分离出了阴沟肠杆菌；在速冻方便食品中，克雷伯氏菌为优势菌，占鉴定出种别的肠杆菌科细菌的50％；在脱水白萝卜丝和脱脂淡奶粉中均检出了团聚肠杆菌；而在冻鱼片中，检出的肠杆菌科属别较多，表明其污染源较为复杂。特别值得注意的是在冻鱼片中还检出了嗜冷性分解脂肪和蛋白质的蜂房哈夫尼亚菌和沙雷氏菌；在冻菜卷中还检出了志贺氏菌。目前，在我国仍广泛采用大肠菌群作为指标菌，很少以肠杆菌科作为食品卫生指标菌，但对欧洲出口食品时有肠杆菌科检测计数要求。