一、关于夹心elisa
夹心elisa测定两层抗体（即捕获抗体和检测抗体）间的抗原。靶抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原位点。
夹心elisa去掉了分析前的样品纯化步骤，提高了灵敏度（比直接或间接法灵敏2–5倍）。
二、实验步骤
1.用捕获抗体包被
①以捕获抗体浓度为1-10μg/ml的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (ph9.6)包被pvc微量滴定板的孔。②未纯化抗体（例如腹水液或抗血清）可能需要增加样品蛋白质的浓度（尝试用10μg/ml）补偿浓度更低的特异性抗体。③用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜。④弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μlpbs。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?
2.封闭和加样①每孔添加 200μl 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/pbs）封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少1-2小时，或在4℃下孵育过夜。③用200 μl pbs洗涤微量滴定板两次。④将100 μl 稀释样品添加到每个孔。通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样品。37°c条件下孵育90分钟。确保标准品浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以获得合适的标准曲线。通常样品和标准品采取两重测定或三重测定。⑤移除样品，用200μl pbs洗涤微量滴定板两次。
3.用检测抗体和二抗孵育
①将100μl稀释的检测抗体添加到每个孔。?确保检测抗体识别与捕获抗体靶蛋白的不同表位。这可防止对抗体结合的干扰。尽可能使用已测试的成对匹配抗体。②用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育2小时。③用pbs洗涤微量滴定板四次。④添加100μl偶联二抗，使用前将其在封闭缓冲液中稀释。⑤用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育1-2小时。⑥用pbs洗涤微量滴定板四次。
三、检测
辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(alp)是elisa测定法中常用的两种检测酶。
考虑到某些生物材料具有高水平内源酶活性（例如肺泡细胞中的高水平alp、红细胞中的高水平过氧化物酶），这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对alp）或用0.3% h2o2的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。
alp底物
对硝基苯磷酸盐(pnpp)是大多数应用常用的底物。室温孵育15–30分钟后在405 nm处测定硝基苯酚呈现的黄色，并加入等量0.75m naoh 终止反应。
hrp显色液
hrp的底物为过氧化氢。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜色发生变化。
tmb（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）
将tmb溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液(2m h2so4)，然后在450nm 处读取光密度。
opd（邻苯二胺二yan酸盐）
在492 nm下测定终产物。底物对光敏感，应将其存放在暗处。
abts（2,2’-联氮-双-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二铵盐）
终产物为绿色，可在416nm处测定光密度。
某些酶底物被认为是有害的（潜在致癌物），因此应始终小心处理并佩戴手套。
四、数据分析
由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在x轴（对数标度）上，而吸光度标在y轴（线性标度）上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。