聚合酶链式反应(pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊dna复制,pcr的最大特点是能将微量的dna大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的dna,就能用pcr加以放大,进行比对。
pcr是利用dna在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°c左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72°c左右),dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
pcr法具有特异性强,灵敏度高,快速简便、纯度要求低等优点,但也存在一些假阴性、假阳性等问题。
pcr原理的图解
pcr(生物学的聚合酶链反应)
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊dna复制,pcr的最大特点,是能将微量的dna大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的dna,就能用pcr加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易dna扩增法,意味着pcr技术的真正诞生。到如今2013年,pcr已发展到第三代技术。1973 年,台籍科学家钱嘉韵,发现了稳定的taq dna聚合酶,为pcr技术发展也做出了基础性贡献。
pcr(聚合酶链式反应)是利用dna在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°c左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72°c左右),dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
1、基本要素和扩增原理
基本要素与dna复制的基本要素是一致的。待拷贝的 dna 称为模板,它可以是双链 dna 也可是单链dna,最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是 dna 复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导 dna 的合成。在 pcr 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。dna 聚合酶是 dna 复制的动力,在 dntp 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 dna 合成互补的 dna 链。
2 、pcr 扩增的步骤
首先将模板 dna 置于 92℃ -96℃,进行变性(denaturation)处理,使 dsdna 在高温下解链成为 ssdna ,且热变性不改变其化学性质;然后退火(annealing) ,将温度降至 37℃ -72℃,使引物与模板的互补区相结合;最后,在 72℃ 条件下, dna 聚合酶将 dntp 连续加到引物的 3'-oh 端,合成 dna ,这个步骤称为延伸(extension)。这三个热反应过程的重复称为一个循环,经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 dna 片段。