ace hilic法开发平台和工作实例
图17显示了hilic方法开发的流程图。
一般方法是：收集分析物相关的信息（如果已知的话），针对三个ace hilic相（用三款不同的ace hilic色谱柱在不同的ph洗脱液条件下）执行梯度或等度hilic筛选实验（取决于样本分析物的亲水性范围），然后再优化色谱法以达到可接受的hilic法。
表1中列出了ace hilic筛选条件。
这些设计旨在探索广泛的选择性范围，以及为达到所需分离提供一个良好的起点。
图17
ace hilic 方法开发流程图
表1
ace hilic筛选实验的条件
参数 备注
色谱柱
ace hilic-a, ace hilic-b and ace hilic-n, 150 x 4.6 mm, 5 µm
梯度流动相
a：10 mm甲酸铵（溶于mecn/h2o中）（94:6 v/v）
b：10 mm甲酸铵（溶于mecn/h2o中）（50:50 v/v）甲酸铵的ph值为：3.0、4.7或6.0.
梯度筛选
时间 %b
0
0
15
100
20
100
21
0
41
0
等度流动相
10 mm甲酸铵（溶于mecn/h2o中）（90:10 v/v）甲酸铵的ph值为：3.0、4.7或6.0.
流速
1.5 ml/min
温度
25 °c
检测
取决于样本（视样品而定）
ace hilic色谱柱保存方法
使用之后，ace hilic色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗，清除掉所有的缓冲盐。
然后，使用100%的异丙醇、以更低的流速进行冲洗，以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖（拧紧色谱柱端盖），并将色谱柱放回盒内。
每次分析运行之后，除非第二天要使用，否则建议采用密闭法（按*保存的方法）清洗色谱柱，然后用异丙醇冲洗。
实例1 – 咖啡茵和相关化合物
方法开发中所需的咖啡茵和四种相关化合物（*、*、次黄嘌呤和黄嘌呤）这些化合物都是极性的中性物质，其中负log p值表示合理的亲水性（log p为负值明确的表明其亲水性），因此适用于hilic（图18）。
图18
咖啡茵和相关物质的结构和log p数据
咖啡茵和相关化合物在ph为3-6的情况下不可电离，因此洗脱剂的ph几乎不会直接影响分子。
为此，选择ph 3.0和4.7。
固定相会受洗脱剂ph变化的影响，这可能是有利的一面。
固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层，这会影响分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氢键的程度。
因此，在ph3.0和ph4.7的情况下对三个固定相进行筛选，结果如图19中所示。
新的ace hilic色谱柱使用60倍柱体积相互平衡（平衡），以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示：三个固定相与两个ph值之间观察到一些选择性差异（三个固定相在两个ph值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异）。
基于筛选数据的有效分离是针对ph为3.0下的（ph为3.0下的）ace hilic-n相。
这些数据选择（选定这些条件）用于进一步优化。
图19
ace hilic色谱柱的梯度筛选
条件如表1中所述，275nm条件下的检测除外。进样25mg/ml的咖啡茵混合物2μl（使用ph3.0和ph4.7的甲酸铵，以0.5%w/w的比例混合相关物质和mecn/h2o（90:10 v/v））
样本：
1) 咖啡茵
2) *
3) *
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤
较早洗脱峰的保留窗口（时间段）非常窄，这表示：等度hilic可用于分离分析物。（等度方式的hilic可以被用于分离这些化合物）10mm甲酸铵，ph3.0（溶于mecn/h2o中）（94:6 v/v）被选为等度条件（图20）。
在这些条件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分离）。
根据梯度运行的结果，乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度），所以梯度hilic分析得到改善（所以梯度分析是对混合物分离有更合适的，温度将被研究），从而开发出终方法，如图21所示。
图20
ace hilic-n相中咖啡茵和相关化合物的等度分析
ace hilic-n相中咖啡茵和相关化合物的等度分析
色谱柱：ace 5 hilic-n，
150 x 4.6 mm
流动相：10 mm甲酸铵，ph3.0（溶于mecn/h2o中）（94:6 v/v）
流速：1.5 ml/min
温度：25 °c
检测：uv, 275 nm
进样：2 μl
样本：
1) 咖啡茵
2) *
3) *
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤
温度的降低会提高*与*之间的解析度（分离度），因此，终方法（图21）被认为适合其用途。
图21
终开发方法：
色谱柱：ace 5 hilic-n，150 x 4.6 mm
流动相：a = 10mm甲酸铵（ph3.0）溶于mecn/h2o中（96:4 v/v）中 b = 10mm甲酸铵（ph3.0）溶于mecn/h2o（1:1 v/v）中
梯度：0-100%b在15分钟内，100%b持续5分钟，下一次进样维持在起始条件20分钟
流速：1.5 ml/min
温度：15 °c
检测：275 nm
进样：2 μl
实例2 – 肌酸和肌酐
肌酸（图22）是使用*和*合成的氨基酸。
它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用（在体内主要用于为细胞供能），并形成（生成）副产品肌酐。测定血液中的肌酐，确定肾功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示肾可能不会*过滤废物。（升高表明肾的过滤废物的功能有所降低）
图22
结构和log p肌酸和肌酐数据
图23
使用ph为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ace hilic范围的等度筛选对比
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸
在三种ph值条件下，利用等度条件对三个hilic固定相的两种分析物进行筛选。
结果表明：肌酐在三个ace hilic相中被适当地保留，但由于过度保留的原因，肌酸在合理的时间内没有洗脱。
根据图17中的流程图，过度保留窗口表示梯度（宽时间段表明梯度方法）可能更适宜。
图24
ace hilic-a相下的终方法
ace hilic-a在ph3.0下选择，进行梯度分析。
标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物，并且解析度很高（分离度很高）（数据未显示）。因此，这使得梯度时间进一步减少（这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少），从而缩短了整体运行时间。
终方法如图24中所示。
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：
a：2 mm甲酸铵（ph3.0）溶于mecn/h2o（90:10 v/v）中
b: 2 mm甲酸铵（ph3.0）溶于mecn/h2o（50:50 v/v）中
梯度：5-55%b，在10分钟内
流速：1.5 ml/min
检测：230 nm
进样：5 μl
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸
结论
hilic是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法（对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式）。
这种方法比较复杂，但如果遵循简单规则，则可实现可再现的hilic方法（hilic方法是可以重现性的）。
三个ace hilic相（固定相）设计用于hilic方法开发期间研究选择性，并尽可能快地提供实现所需分离的选项。
ace hilic方法验证协议（规程）已成功用于开发一系列的hilic方法，应为hilic方法开发活动提供一种结构化的方法。