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本周第五期电转百科我们将更进一步，为大家带来crispr基因编辑的内容，本章内容将分为knock-out与knock-in上下篇，请继续关注下一期的后续！
01/上篇
knock-out
lonza nucleofector™核转染系统可以广泛应用于多种不同的场景，在不同的应用场景下通常会使用dna或rna或蛋白进行外源基因的递送，以实现特殊的应用需求。
以crispr系统为例，全球有大量的客户使用lonza nucleofector™核转染系统开展基于crispr系统的基因编辑相关工作并发表文章且逐年递增。
▲google scholar search for ‘nucleofector crispr’, july 2023
·对于crispr的转染，即可以通过表达cas9的质粒系统如px458载体来实现“剪刀” cas9的递送，也可以通过cas9 mrna的方式在细胞质中直接翻译，与sgrna形成复合物后再进入细胞核进行基因组编辑。当然我们也可以在转染前提前将cas9蛋白与sgrna进行孵育形成rnp复合物，再通过电转染递送到细胞内，直接进入细胞核进行基因组编辑。
·对于crispr应用，主要用于knock-out或knock-in
knock out：尽管knock-out已经比较容易实现高效的敲除效率，但对于陌生的细胞或者全新的位点依然需要进行适当的调整。包括但不限于以下方面：
不同的nucleofection条件测试
lonza为多种常用的细胞提供预优化的电转程序，电转程序与细胞相关，通常来说，即使电转不同的核酸底物(dna，rna，蛋白等)无需对电转程序进行调整，但在越来越多的原代细胞转染中，使用rna或rnp进行细胞基因编辑时，可以通过对程序进行适当的微调，以获得更高编辑效率的同时，更好的维持细胞的活率及功能。对于常见的t cell，hspc，nk，dc等免疫细胞可以对nucleofection脉冲条件进行适当调整。
▲akiko seki et al., 2018
不同的crrna/sgrna测试
对于同一基因不同的sgrna表现可能不同，目前已有大量设计sgrna序列的工具，部分工具也可以为其打分，但通常还是建议尽可能测试多个sgrna以确保实验结果。甚至结合多条sgrna对同一基因进行编辑。
▲akiko seki et al., 2018
不同cas9蛋白的测试
对于不同供应商的cas9蛋白也存在切割活性的差异，对于wt cas9和一些经过优化的cas9蛋白也会导致编辑效率的差异。
▲akiko seki et al., 2018
▲liyang zhang et al., 2021
cas9用量测试
除对不同cas9蛋白来源的测试外，cas9的用量也是需要在试验优化中考量的因素。
▲liyang zhang et al., 2021
cas9:sgrna比例测试
对于cas9蛋白和sgrna形成的蛋白复合物，以何种比例添加进行孵育转染必定也是重要的因素。在大多数的出版物中，cas9:grna的比值在1:1.2 - 1:5之间。
▲akiko seki et al., 2018
electroporation enhancer
有时可以考虑使用electroporation enhancer以实现更高的编辑效率。
▲matteo martufi et al., 2019
市面上大多数提供cas蛋白或sgrna的供应商通常也会提供一份详细的protocol，可以优先参考这些protocol或相关的paper。除上面提到的方向外，供体差异，转染的时间点，对于免疫细胞(如t细胞)，何种激活剂激活也可能会对最终的结果造成影响。