PCR 反应特异性优化方法合集

发布时间:2024-03-29
聚合酶链反应(pcr)技术是在体外进行的由引物介导的酶促dna扩增反应。pcr 反应特异性优化方法合集:
1. 引物的设计
引物最好在模板 cdna 的保守区设计,长度 15-30bp,gc 含量小于 60%,3’端不超过连续三个 g 或 c,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行 blast 检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。
2. 降落 pcr
降落 pcr 是一种简单的降低非特异性产物的 pcr,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使 pcr 效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落 pcr 提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高 pcr 的特异性和效率。
3. 热启动扩增
采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高 pcr 反应特异性方式。在一般的 pcr 反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将 pcr 仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有 dna 链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前抑制酶的活性,方法就是使用热启动 taq 酶(或热启动高保真聚合酶)去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到 95℃时恢复活性,指导扩增。
4. 巢式 pcr
采用巢式 pcr 进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通 pcr 不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通 pcr,然后将第一轮扩增的产物稀释 100 倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式 pcr 可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。合适的琼脂糖凝胶的浓度。
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