重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa）是piepenburg等人在2006年利用参与细胞dna合成的蛋白重组和修复开发出的一种新的核酸恒温扩增技术。该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域[1]。
一、rpa技术原理rpa技术主要依赖于能结合寡核苷酸引物的t4噬菌体来源的重组酶t4 uvsx、单链结合蛋白gp32和链置换bsu dna 聚合酶以及两条特异性的上下游引物实现扩增，具体扩增原理如图1所示：
图1.重组酶聚合酶扩增rpa技术扩增原理图[2]
1.重组酶引物复合体的形成：重组酶t4 uvsx在atp的参与和定位因子（t4 uvsy）的帮助下与扩增引物结合形成重组酶引物复合体，并在双链dna中寻找同源序列；
2.重组酶引物复合体定位至同源序列：重组酶引物复合体一旦定位到同源序列，则会插入双链dna形成d-环结构，启动链置换反应，单链结合蛋白gp32会与解开的dna链结合防止进一步被置换。
3.链置换扩增启动：重组酶t4 uvsx从重组酶引物复合体中被水解，3'端引物暴露并与bsu dna聚合酶结合，dna开始复制延伸，最终两条母链分离，形成两条新的互补双链dna。该反应在37-42℃下进行，可在30 min内实现目标序列1012倍的扩增。
二、rpa技术优势1. 检测灵敏度高：可将痕量的核酸模板（低至单拷贝）扩增至可以检出的水平，且通常无需进行核酸纯化。2. 无需昂贵的配套仪器设备：37~42°c恒温反应，无须热循环，摆脱仪器束缚，方便快捷。3. 样本耐受性高：适合复杂样本的扩增检测。例如未经核酸纯化的血液或鼻拭子，只需要通过热或碱进行预处理促进核酸释放即可。4. 检测方法多样化：包括电泳法检测、荧光探针法检测、侧流层析试纸条检测等。
三、rpa技术应用rpa技术可用于不同种类的目标生物检测，如细菌、真菌、病毒、原生动物等的双链dna、单链dna、甲基化dna以及通过rna或mirna反转录产生的cdna等核酸样本。rpa技术目前已被成功应用于农业、医学、食品、疫病防控等领域，具有广阔的应用前景。
图2.rpa技术应用
四、rpa技术核心酶原料翌圣zymeeditor™酶改造平台针对rpa技术，目前已获得rpa全系列性能优良的产品，包括链置换bsu dna polymerase、t4 uvsx recombinase、t4 uvsy protein、t4 gene 32 protein、肌酸激酶creatine kinase和exonuclease iii。
翌圣rpa产品选择指南
产品名称 产品货号 产品作用
bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl) 11078es 结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的dna模板
t4 uvsx recombinase (2 μg/μl) 11079es 具有配对和链转移活性的重组酶
t4 uvsy protein (2 μg/μl) 11080es 重组酶辅助因子，刺激t4 uvsx的单链dna依赖性atp酶活性并降低活性所需的t4 uvsx临界浓度
t4 gene 32 protein (gp 32) t4噬菌体基因32编码蛋白 11081es 参与dna复制、修复、重组与解链后的单链dna结合，防止自杂交
creatine kinase (2 μg/μl) 肌酸激酶 14502es 刺激atp和肌酸分解为磷酸肌酸和adp，释放能量
exonuclease iii (100 u/μl) 14525es 具有3’→5’外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光
客户测试案例展示
客户采用翌圣bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl)、t4 uvsx recombinase (2 μg/μl)、t4 uvsy protein (2 μg/μl)、t4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶creatine kinase (2 μg/μl) 进行rpa扩增反应，得到正确的目的条带，且条带清晰、明亮，结果表明，pra技术核心酶原料可实现高效rpa等温扩增。
图3 客户测试翌圣重组酶聚合酶核心酶原料扩增结果图
注：2、4为阳性实验组；1、3为阴性对照组
参考文献
[1] zhao y, chen f, li q, wang l, fan c. isothermal amplification of nucleic acids. chem rev. 2015 nov 25;115(22):12491-545. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00428. epub 2015 nov 9. pmid: 26551336.
[2] 王亚楠, 陈昌国. 重组酶聚合酶扩增技术研究进展[j]. 医学杂志, 2021, 46(5):8.