单壁碳纳米管（swcnts）因在近红外（nir）区域有稳定的光致发光特性而在生物成像领域应用颇多。单链dna可以通过非共价键与swcnts结合（dna-swcnts），使swcnts有更好的生物相容性。研究表明，swcnts进入人体之后，会被巨噬细胞“内化”，并在溶酶体定位。对swcnts的表面进行修饰，可以改变swcnts在细胞内的“命运”。但是，人们对dna单链的长度如何影响dna-swcnts在复杂细胞环境中的代谢知之甚少。
2019年3月，美国罗德岛大学daniel roxbury教授课题组在《nano letters》发表题为“biomolecular functionalization of a nanomaterial to control stability and retention within live cells”的文章，介绍了dna-swcnts与细胞之间相互作用的关系。
dna单链的长度与dna-swcnts荧光强度的关系
为了研究dna单链的长度对dna-swcnts光学特性的影响，作者先用五种单链dna（(gt)n，n=6，9，12，15，30）对swcnts进行修饰，后与小鼠巨噬细胞一起培养30分钟（(gt)n-swcnts浓度：1mg/l）。当用730 nm激光激发时，大多数细胞表现出明亮的宽频发射（900-1600nm），说明dna-cnts被细胞“内化”。作者探究了荧光强度与dna单链的长度和时间的关系，结果显示，dna-swcnts荧光强度与dna单链长度成正比而与时间成反比。有趣的是，具有较长dna单链的dna-swcnts的初始的荧光强度分布较广，说明长链dna使dna-swcnts对近红外光更敏感。作者对细胞内dna-swcnts的荧光强度进行了量化并计算了细胞内的平均荧光强度，发现细胞内的荧光强度随着dna链长的增加而增加，皮尔森相关系数分别为0.846、0.885和0.850，证实两者线性相关且具有统计学意义（图1）
图1：dna-swcnts的荧光强度与dna单链长度的关系；（a）(gt)15-swcnts的荧光图像、白光图像和整合的荧光/白光图像；（b）dna-swcnts的荧光图像；（c）dna-swcnts荧光强度柱形图；（d）dna-swcnts的平均荧光强度
dna-swcnts荧光强度与dna单链长度和swcnts手性的关系
为了进一步比较swcnts手性与荧光稳定性的关系，作者将发射中心波长转化为能量，并将dna-cnts的荧光强度与对照组做了对比。研究表明，5种dna-swcnts中，只有(gt)6-swcnts荧光强度随时间的延长而增加，其他4种dna-swcnts的荧光强度有适度的损失。对于某一种手性的swcnts而言，(gt)n-swcnts荧光强度损失没有在同一时间段内发生，说明荧光强度的损失是多种因素的结果。为了在单细胞水平上研究光谱位移，作者利用高光谱技术绘制了(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的高光谱图像，并将高光谱图像中每一个包含swcnts像素点拟合到洛伦兹曲线上，用(94)-swcnts的中心辐射能量图覆盖白光图，并为每个图像构建直方图以描述细胞内swcnts发射能量的变化。作者发现，0h的时候，(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的荧光强度在统计意义上*相同。将直方图进行高斯拟合，可以通过半全宽来评估总体的异质性。研究表明，内化后(gt)6-swcnts的半高宽是(gt)30-swcnts的两倍，且(gt)30-swcnts的辐射强度不随时间变化。6 h后，(gt)6-swcnts的发射能量降低了8 mev，半高宽降低了50%。作者认为，这种近红外光荧光强度的变化是dna-swcnts复合物的dna单链末端相对丰度变化的结果，对于dna-swcnts中一定质量的dna，(gt)6-swcnts中dna单链数是(gt)30-swcnts的5倍（图2）。
图2：荧光强度与dna单链的长度和swcnts手性的关系；（a）细胞内荧光强度的热图；（b）(gt)6-swcnts和（c）(gt)30-swcnts的白光图和高光谱图像的叠加图和荧光能量分布直方图
细胞内dna-swcnts荧光强度的稳定性
被细胞内化的dna-swcnts的光谱稳定性有较大差异。作者基于swcnts对常规有机荧光团的淬灭效应，设计了一种检验dna-cnts完整性的方法。实验人员首先用cy3对(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts进行标记，脱氧胆酸钠（sdc）小分子通过竞争机制取代cy3-dna附着在swcnts的表面，使原来发生荧光淬灭效应的swcnts重新发出明亮的荧光。尽管sdc的置换动力学不相同，但cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的荧光淬灭动力学是相似的。当用含有cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的细胞培养物培养巨噬细胞时，cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的荧光淬灭现象有很大的不同，cy3-(gt)6-swcnts很快的发生荧光淬灭并在4 h达到maximum荧光强度，24h后降至初始荧光强度；相比之下，cy3-(gt)6-swcnts则在任何时间段均未观察到荧光淬灭现象（图3）。
图3：dna-swcnts在细胞内的稳定性；（a）实验设计示意图：swctns被dna单链紧密包裹时，未发生荧光淬灭现象，dna单链解离时发出强烈荧光；（b）荧光强度随sdc小分子置换时间的增加而增加；（c）用cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts培养的raw 264.7细胞的白光图和荧光图的叠加；（d）平均荧光强度直方图
细胞对dna-swcnts的“内化”和“外排”
尽管swcnts的荧光强度受到浓度和局部环境的影响，但是swcnts的某些特征只和浓度有关，这就意味着，无论样本的荧光强度如何，swcnts的手性信息在拉曼图谱中都可以被表达出来。作者使用共聚焦拉曼显微镜评估了swcnts在细胞内的局部浓度，首先使用1mg/l的cy3-(gt)6-swcnts或cy3-(gt)30-swcnts培养巨噬细胞30分钟，对0.5μm的微小区域进行拉曼成像。为了计算出每个细胞内swcnts的质量，作者得出了g峰与swcnts浓度的特征曲线。cy3-(gt)6-swcnts培养的巨噬细胞中swcnts的起始浓度是cy3-(gt)30-swcnts培养的巨噬细胞的两倍；24 h后，cy3-(gt)6-swcnts培育的巨噬细胞内swcnts的浓度下降了75%，而cy3-(gt)30-swcnts培育的巨噬细胞内swcnts的浓度下降较小。作者将cy3-(gt)6-swcnts培育的巨噬细胞内swcnts的起始浓度高的原因归结于单根swcnts上的dna密度较大，这增加了细胞膜蛋白与dna相互接触的概率；相反，也正是由于膜蛋白与dna接触概率的增大，从而使得巨噬细胞可以更快的以胞吐的形式“释放”swcnts。
为了更好的理解胞吐机制，作者对细胞“释放”(gt)6-swcnts的途径进行了探究。作者设计了一个实验，用巴弗洛霉素a1和诺考达唑（两种抑制细胞溶酶体胞吐作用的化学药物）对巨噬细胞进行了处理，并比较细胞内dna-swcnts的浓度。结果显示，(gt)6-swcnts在细胞内的浓度高于对照组，(gt)30-swcnts的浓度与对照组相比变化不大；相反，用布雷非德菌素a和exo1（两种抑制高尔基体分泌的化学药物）对巨噬细胞进行处理，结果显示，(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的浓度与对照组相比差异性较小；这说明细胞主要是通过溶酶体的胞吐作用来实现dna-cnts的“释放”（图4和图5）。
图4：通过共聚焦显微镜确定swcnts的浓度；（a）cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts培养的raw 264.7细胞的g峰强度图和白光图（b）从细胞中roi区域像素点计算得出的swcnts的浓度；（c）被细胞内化的swcnts的比值；（d）细胞上清液中外源性swcnts的浓度；（e）共聚焦拉曼光谱g峰强度图与白光图的叠加；（f）在（e）图中包含swcnts的所有像素点的平均浓度
溶酶体胞吐的主要功能之一是分泌各种生物大分子，如蛋白质、酶和抗原，以进行细胞之间的信息传递，也可使周围细胞产生免疫反应。有研究表明，对swcnts的表面进行修饰可以有效降低对细胞的毒性，原始的swcnts与细胞膜上的受体相互作用之后会被认为是一个有害物质。因此，作者认为溶酶体将dna链段从dna-swcnts复合物上去除后，会使得细胞将“裸露”的swcnts当做异物，而引发细胞的胞吐作用将其排出，导致细胞内swcnts的浓度降低；而长链的dna对swcnts的包覆比较严密，溶酶体无法将dna-swcnts复合物上的dna“剔除”，从而无法产生胞吐作用，这会导致(gt)30-swcnts在细胞内的滞留。
图5：dna长度相关性的细胞内加工示意图；（a）巨噬细胞将(gt)6-swcnts复合物内化并在溶酶体内定位，随后生物分子与dna链发生交换，并迅速诱导溶酶体胞吐；（b）巨噬细胞将(gt)30-swcnts复合物内化并在溶酶体内定位，而dna-swcnts的完整性使swcnts被长时间保留在细胞内
总结：
作者借助于可见-近红外高光谱成像和共聚焦拉曼显微技术，发现dna单链的长度对dna-swcnts的光学稳定性有影响，通过调节dna单链的长度可以实现对细胞“摄入”和“外排”swcnts的调节；dna-cnts上较短的dna单链在溶酶体内被细胞的生物小分子取代，改变了swcnts的物理特性和在细胞内的“命运”；最后通过药物实验证实了细胞对swcnts的“外排”是通过胞吐作用。这些发现有助于人们进一步理解swcnts与细胞之间的相互作用，也为后续科研人员进一步探究细胞对官能化小分子的“响应性”奠定了理论基础。
参考文献
[1] gravely m, safaee m m, roxbury d.biomolecular functionalization of a nanomaterial to control stability andretention within live cells[j]. nano letters, 2019, 19(9) 6203-6212.