：人工合成的系列偶氮类工业染料，分为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ号。国际癌症研究机构将ⅳ号列为三类致癌物，其初级代谢产物邻氨基偶氮甲苯和邻胺均列为二类致癌物，均有一定的潜在致癌作用。
近年来欧盟和我国都严禁使用作为食品添加剂，参考国家标准gb/t19681-2005《食品中染料的检测方法高效液相色谱法》，我们采用反相高效液相色谱仪对i号、ii号和iv号进行了测定。
1、方法原理
样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。
2、主要仪器和试剂
1）【上分】牌高效液相色谱仪，二元高压梯度；
2）电子天平；
3）超声波水浴；
4）旋转蒸发仪，5）离心机，6）检测专用固相萃取柱；
6）标准储备液：准确称取适量标准物质，用乙腈配制成10µg/ml的标准贮备液待用。
3、 实验方法
3.1样品制备
3.1.1样品提取准确称取咸鸭蛋黄1.0g于三角瓶中，加入10ml正己烷，涡旋1min后振荡5min，超声5min，4000r/min离心5min，收集上清液。下层残留物用10ml正己烷按上述步骤重复提取一次，合并两次上清液，用旋转蒸发仪浓缩至近干，再加入5ml正己烷混匀，待用。
3.1.2spe柱净化：
1）活化：检测柱使用前用10ml正己烷活化；
2）上样和洗脱：检测柱上加入待净化液，弃去流出液；依次加入5ml正己烷、5ml1%乙酸乙酯正己烷淋洗，弃去淋洗液；再加入10ml30%乙酸乙酯-正己烷溶液，收集洗脱液。（整个上样洗脱过程均保持流速1ml/min)
3）洗脱液在40℃下减压蒸馏近干，加1ml40%甲基叔丁基醚甲醇溶液定容，过0.45μm滤膜后供hplc分析。
3.2、高效液相色谱仪参考条件
色谱柱：c184.6mm(i.d)×250mm，5μm；
梯度程序：流动相a:乙腈 流动相b:0.2%磷酸水溶液
功能
t(min)
a(%)
b(%)
0
18
88
12
1
2
100
0
0
10
100
0
1
0.1
88
12
0
9.9
88
12
流速：1ml/min；
柱温：40℃波长：518nm；
进样体积:20μl
测定：取相同体积试样制备液和标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间按定性，外标峰面积法定量。
4、 实验结果
4.1高效液相色谱图
2.5μg/mli、ii、iv混合标准样品
1、i2、ii3、iv
4.2工作曲线的绘制
i号工作曲线见下图，线性相关系数：0.9997
5、 小结
实验中前处理步骤选用专用的萃取小柱，去油效果佳，能有效去除油酯等干扰，有较高的回收率和稳定性；采用二元高压梯度，三种组分有很好的分离效果和重复性。此方法也适用于其他食品基质中的检测。