高效液相色谱仪色谱填料分析：分离亲水气单胞菌外毒素的功能高分子凝胶色谱填料
曾庆冰 ， 许 家瑞 ， 符若文， 叶巧真
中山大学生命材料科学研究所， 广东 广州 5 1 0 2 7 5
聚合物基复合材料与功能材料重点实验室
摘要 由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油悬 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝胶 z s p， 并用 i r、 溶
剂吸收 实验等对合成 的 z s p的结构进 行了确证 。以商 品葡聚糖凝 胶色谱 s e p h a d d e x — g1 0 0为对
照 ， 研究 了 zs p 一 1 0对 中华鳖致 病的亲水气单 胞菌外毒素蛋 白的分 离性能 ， 结果 表明经 s e p h a d e x —
g1 0 0和 z s p一 1 0提纯的外毒素蛋白均保留了生物活 （ 毒） 性 ， 纯度高 。 从 s ds — p age分析结果 ， 可以
认为经提纯的毒素蛋 白是分 子量 为 3 2 kda的纯品。与 s e p h a d e x — g1 0 0凝胶相 比， 聚丙 烯酰胺凝胶
色谱填料 z s p一 1 0对 蛋 白质 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的应 用前景 的蛋 白
质分离色谱填料。
关键词 ： 亲水气 单胞菌外毒素 聚丙烯酰胺凝胶
1 前言
在生物技术制取蛋 白质 的多级纯化过程
中， 液相色谱被为一个必须步骤 ， 这表明操
作条件温和、 又具有分子水平分离能力的液相
色谱为开创现代生物大分子化学树立了一个里
程碑。在液相色谱 中， 无论是哪一种层析方法 ，
分离介质 的性能都是分离效果 的首要决定 因
素。目前所使用的多糖类蛋白色谱分离存在的
普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等问题 。开
发高效的蛋 白分离介质受到国内外学者的广泛
关注。蛋白分离层析介质 的发展趋势可以认为
是对以天然大分子为母体 的层析介质不断地进
行合成工艺改进 ， 提高性能 ， 使老产品更新换
代； 同时大力开发以合成高聚物为骨架 的具有
优异性能的新一代产品。
亲水气单胞菌在 自然界尤其在水体环境中
分布甚广， 属弧菌科， 能引起人和动物的多种疾
病n ， 特别是水生动物暴发性传染病 ， 此病在我
国东南各地广泛流行 ， 尤 以水温较高的夏秋季
为剧， 导致水生养殖鱼类大量死亡， 给渔业生产
造成重大经济损失 矗 。
亲水气单胞菌在习惯上被认为是条件致病
菌 ， 随着细菌本身的研究的深入 ， 这一认识正在
被修正 。已有报道该菌的 o抗原、 菌毛及一些
表 面的非特异性粘附因子与该菌的致病性有
关“ 。 然而， 更多的报道指出致病侏能产生细胞
外毒素 ， 而毒素与致病关系密切 ~ 7 。 但是关于
毒素的种类和性质诸说不一 ， 未有定论。 我们用
自制的凝胶色谱介质对 中华鳖致病的亲水气单
胞菌素进行了分离。
2 实验部分
2 ． 1 菌种
亲水气单胞菌菌株从广东省东莞市某养殖
场患病的中华鳖中分离鉴定， 取材选取濒死新
本研究由国家 自然科学基金委杰 出青年科学基金资助（ 项 目编号 ： 5 9 6 2 5 3 0 7 ）
2 ． 2 细菌培养
亲水气单胞菌菌株接种合成培养基 中， 摇
床培养 3 5 ℃， 1 0 0 r ／ mi n， 2 4 h。 培养物经 4_ c， 1 o
0 0 0 r ／ mi n离心 3 0 mi n ， 取上清液。 将此上清液
对小 白鼠（ 体重 1 8 ~2 2 g ） 腹腔进行注射（ 剂量
为 0 ． 4 ml ／ 只） ， 确证其生物活性 。
2 ． 3 聚丙烯酰胺凝胶色谱填料 z s p的合成
在 甲 苯 和 溶 剂 中加 入 少 量
twe e n 一 8 0和 1 9 ／ 6 ， 滴加丙烯酰胺和甲
又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 v水浴恒温 ， 滴加完毕待
分散均匀后加入适量过硫酸铵， 待反应完成后 ，
撤去水浴 ， 体系 自然冷却至室温， 减压抽滤 ， 真
空干燥 ， 筛选出 2 0 0 ~3 0 0目产物备用。
2 ． 4 红外分析： 采用布鲁克 equi nox 5 5傅
里叶变换红外光谱仪 ， 波数范 围为 4 0 0 ~4 0 0 0
c m～， 样品采用 kb r压片法进行测试。
2 ． 5 溶剂吸收实验
将干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2 g z s p聚合物
凝胶置于一特制的底部带有多孔玻璃砂板的试
管中， 在室温下置于溶剂 （ 水） 中浸泡 2 4 h。试
管用橡胶盖密封 ， 放到一离心管内， 用 2 0 0 0 ~4
0 0 0 r ／ mi n离心 1 5 mi n除去过量的溶剂 ， 将带
有溶胀剂的树脂的试管迅速转移到密闭的烧瓶
中称重。溶剂吸收量用 1 g干树脂 吸收的溶剂
重 量来表 示 。
2 ． 6 毒素的提纯
2 ． 6 ． 1 硫酸铵盐析
用 na oh调节细菌培养物上清液至 p h 6 ，
再加入硫酸铵至 7 o 的饱和度 ， 4 ℃静置 4 h，
1 0 0 0 0 r ／ mi n， 4 ℃离心 3 0 mi n， 去上清液， 沉淀
溶于洗脱缓冲液 中， 对相同缓冲液透析过夜 ， 将
透析后的样品用 p eg2 0 0 0 0进行浓缩 ， 即为粗
提毒素。
2 ． 6 ． 2 s e p h a d e x g一 1 o 0凝胶过滤
将粗提 毒素 于 4 ℃装 s e p h a d e x g1 0 0柱
（ p h a ma c i a产品， 1 ． 6×5 0 c m， 平均液及洗脱液
均为 5 0 mmo l ／ l tr i s — hc1 ， p h 7 ． 8 ） ， 流速为 1 2
ml ／ h， 每管收集 4 ml ， 用紫外检测仪 2 8 0 n m进
行检测， 合并生物活性部分 ， 冻干浓缩。
2 ． 6 ． 3 z s p 一 1 0凝胶过滤
将 粗 提 毒 素 于 4 n c装 交 联 度 为 1 o 9 ／ 5 的
z s p 一 1 0 柱 （ 自制 ， 1 ． 6 ×5 0 c m， 平衡液及洗脱液
均 为 0 ． 2 mo l ／ i na ac — hac ， p h5 ． o ） ， 流速为
1 2 ml ／· h， 每管收集 4 ml ， 用紫外检测以 2 8 0
n m进行检测 ， 合并生物活性部分， 冻干浓缩 。
2 ． 7 sds— page
采 用 la e mml i 不 连续 s ds — p age系统 ，
按常规方法在小型蛋白电泳仪上进行 1 0 0 v恒
压电泳约 3 h。 所用分离胶浓度为 1 2 9 ／ 6 ， 浓缩胶
浓度为 4 9 ／ 6 ， 用考马斯兰法染色。
2 ． 8 小 白鼠毒性试验
小 白鼠体重 1 8 ～2 2 g， 每组 2只， 分别腹腔
注射 0 ． 4 ml 毒素样品。
3 结果与讨论
3 ． 1 i r分析
图 1 聚丙烯酰胺凝胶填料的 i r谱图
图 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 胶 渗 透色 谱填 料 而引起的。 3 1 8 8 c m 处的强峰是 n— h伸缩振动
z s p 一 1 0的红外谱图。3 3 9 4 c m 处宽而强的峰是 吸收峰。 2 9 3 2 c m 和 2 7 8 1 c m 处的强峰是 ch
一
oh伸缩振动的谱带 ， 由样 品中残留水分存在 基团中不对称和对 称 c— h伸缩振动峰。1 6 6 3
—
1 9 —
chi nes e j ． di al ． & arti f． organs vo 1 ． 1 4 no ． 1 ma r c h， 2 0 0 3
c m。 处的强峰是 c=0伸缩振动吸收峰。1 4 0 0
c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰
是 c— n伸缩振动和一 nh变形振动引起的。6 2 7
c m 处的峰是 n— h面外变形吸收峰。
3 ． 2 z s p树脂的吸水率
图 2是 z s p树脂吸水率一交联度曲线。 很
明显， 在交联度为 5 ～2 0 的范围内树脂 的
吸水率与交联度成正 比。 由此可推测， 在所合成
的聚合物中交联点的分布是 比较均匀的。
o0 5 ．o o％ i o． 00 ％ l 5 ． o0 ％ 2 0． o（ 2 5 |t ） 儡
空娃度
图 2 z s p树脂吸水率一 交联度 曲线
3 ． 3 毒素的纯化
粗提毒素经 s e p h a d e x- -gl o 0凝胶色谱柱
纯化后 回收率为 1 8 ． 8 3 ， 经交联度为 1 0 的
聚 丙 烯 酰 胺 z s p 一 1 0柱 纯 化 后 回 收 率 为
6 8 ． 0 5 ， 洗脱液蛋峰分别为图 3和图 4 。上样
后 s e p h a d e x a —g1 0 0湿凝胶 在 4 ℃只能保 存
■ d ■’ h● ¨
图 3 毒素的 s e p h a d e x — g 1 0 0层析
3 ． 4 sds— page
经 s e p h a d e x—g 1 0 0和聚丙 烯酰胺 z s p一
1 0柱纯化后的毒素进行 s ds — p age， 考马斯兰
图 5 s e p h a d e x纯化 s ds — p age
行 m： 分子量标准 ， 行 a：
粗提毒素 ． 行 b： 提纯毒素
1 0天左右即会滋生霉菌， 不能再重复使用。而
z s p 一 1 0 在 同样的条件下可保存半年。 提纯毒素
经浓缩后注射小 白鼠， 2 4 h后小 白鼠死 亡， 可
以认为两种凝胶色谱柱均保留了外毒素蛋白质
的生物 活性 。
图 6 zs p 一 1 0纯化 s ds — page
行 m： 分子量标准， 行 a；
粗提毒素 ， 行 b ： 提纯毒素
4 结论 1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油悬液中
共 聚得 到交 联度 为 1 0 的 聚丙 烯 酰胺 凝胶 ‘
z s p 一 1 0 。z s p 一 1 0对使 中华鳖致病 的亲水气单
胞菌外毒素蛋 白的分离性能 良好 ， 保留了生物 ．
活（ 毒） 性， 纯度 高。 从 s d s — p ag e分析结果 ， 可
以认为经提纯 的毒素蛋白是分子量为 3 2 kda 5
的纯品。与 s e p h a d e x — g1 0 0凝胶相比， 聚丙烯
酰胺凝胶色填料 z s p一 1 0对蛋 白质 的回收率更 6
高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好的应用
前景的蛋白质分离色谱填料。 7
参考文献
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4 3 8
（ 收稿 ： 2 0 0 0 — 1 0 — 1 8 ）
群体反应性抗体（ p ra） 高的免疫吸附治疗
于 颖 ， 孟 建中
济南 *总医院血液净化 中心 ， 山东 济南 2 5 0 0 3 1
摘 要 目的 ： 研究高群体反应性抗体 （ p ra） 的患者进行 肾移植， 术后常发生超急性 （ har）
或急性排斥 （ ar） 反应 ， 导致移植肾功能 丧失 。方 法； 1 8例 pra高的患者行免疫吸附 （ 1 a） 治疗
前血液透析 1 ～6年。8例第 2次肾移植 ， 3例第 3次肾移植 。p ra 2例>7 o ， 5例 >5 o ， 5例
>3 o ， 6例>2 o 。 采 用 日本 p l a s a u t o — l q免疫吸附系统机进行 免疫 吸附治疗 。 结果 ； 1 8例 p ra
高 的患者行 l a 治疗 3 ～8次后 ， 复查 pra． 9例为 0 ， 6例<5 ， 3例 <1 o ， 都 达到了治疗效果 。
结论 ： p ra 的检测对提 高肾移植 成功率和存活率具有实际意义 ． 移 植后未发生 har和 ar， 为
患者解决 了因 pra 高而不能 肾移植 的难题 。
关键词 ： 群体反应性抗体 免疫吸附治疗 肾移植
肾移植是治疗慢性肾功能不全终末期肾衰
的主要方法， 若移植后的肾功能恢复正常，
其发挥的作用远大于任何类型的透析。肾移植
的优势还在于能使患者骨髓代谢恢复正常 ， 消
除贫血， 并能正常生活与工作。 而群体反应性抗
体（ p ra） 高的患者进行 肾移植， 术后常发生超
急性 （ har） 或急排 斥 （ ar） 反应， 导致移植 肾
功能丧失 ， 甚至危机患者生命 。为解决这一难
题， 我院 自2 0 0 1年 1月至今， 为 1 8例患者行免
疫吸附（ i a） 治疗疗效显著 ， 现总结如下 。
1 资料与方法
1 ． 1 一般资料
我院 自2 0 0 1年 1月至今为 1 8例 pra高
的患者行免疫吸附（ i a） 治疗 ， 男性 1 1例， 女性
7例 ， 年龄 1 8 ～6 5岁。 9例原发病均为慢性肾小
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