荧光照射条件下的显微照相呈现出一组*的环境，为显微镜专家带来了特殊问题。曝光时间通常非常长（在某些情况下从几秒钟到几分钟），样品的荧光在曝光期间可能会褪色，而*黑色的背景通常会无意中发出光度计信号，表明过度曝光。
另外，荧光标本发射它们自己的光，并且位于所需焦平面上方和下方的粒子经常辐射光，导致图像细节模糊。尽管通过显微镜目镜观察时荧光图像可能看起来很亮（由于人眼对光线的敏感性），但为了在胶片上记录令人满意的图像，它们通常需要较长的曝光时间。非常长的曝光使得用荧光染料染色的样本的显微照相复杂化，增加了振动的可能性和膜互易失效效应，导致图像中不希望的色移。
虽然荧光显微照相的基本问题通常是光线到达胶片的缺乏，但是可以采取许多步骤来改善图像质量。用于荧光的显微镜物镜应具有尽可能高的数值孔径，在实验中使用光波长的高透射率值。因为光强度（反射光荧光）随数值孔径的四次方变化，所以这些物镜可以显着减少反射光荧光显微镜中的曝光时间。光强度也与放大倍数的平方成反比变化，当胶片上的总放大率保持小时，导致更亮的图像。通常使用低放大率光学镜（或投影镜头）来辅助降低胶片平面上的放大率。此外，当使用三目头时，通常希望将所有光转向摄像机，而不是在观察目镜和摄像机之间进行光分离（通过分束器）。因为图像强度也与到胶片平面的距离的平方成反比地变化，所以显微镜表现得更好，然后该距离保持很短。出于这个原因，并且由于广泛的可用性，当使用传统的显微摄影术捕获图像时，大多数荧光显微镜记录在35毫米胶片上（而不是更大的格式）。
低光照水平和荧光标本的褪色是荧光显微照相术中要克服的两个主要困难。通常，荧光制剂的动态性质使得良好的显微摄影术对于捕获与样本发生的事件的记录是必要的，并且通常可以在通过目镜检查样本时揭示不明显的细节。长时间曝光，如此常用于荧光，不可避免地导致在长时间照射期间的互易失效和样本荧光强度的褪色。实际上，特定荧光特征的衰落通常比背景的快，导致图像对比度的损失。
所有照相乳剂（包括黑色和白色，彩色负片和彩色透明膜）在暴露于光下超过长时间或短时间时都会受到称为互易律失效的影响。互易律将图像密度与曝光时间和光强度联系起来，使得显微镜中的照明强度与胶片所需的曝光时间之间存在相互关系。实际上，该法律规定曝光时间与光强度成反比，以保持恒定的胶片密度。光强度越低，产生令人满意的图像所需的曝光时间越长。如果适当的曝光持续时间在1/500秒和1/2秒之间，则这种反比关系适用于大多数胶片。
在荧光显微镜中，低光照水平通常需要超过1/2秒的曝光（通常在几秒到几分钟的范围内）。在这些条件下，互易关系不再成立，并且胶片将需要额外的曝光时间以产生适当的图像密度。这种现象称为互易失效，该术语仅表示曝光时间和光强度之间的线性关系不再成立，并且不表示薄膜乳液在性能方面的失效。
互易律失效的副作用是通过样品的光漂白进一步降低已经很弱的样品荧光，并且由于曝光时间增加经常发生不正确的颜色再现。图2中呈现的一系列图像是荧光显微照片，其示出了当使用olympus wib长通荧光立方体成像时用流行的荧光素-5-异硫氰酸酯（fitc）标记的抗体荧光染料。使用针对互易律失效校正的校正曝光时间和kodak wratten颜色补偿滤光器拍摄中心的单元（图2（b）），以消除不希望的色移。在左侧（图2（a）），相同的视野显示了由于长时间暴露于照射源而导致的光漂白或荧光活性的褪色的影响。
通常可以通过增加曝光时间或黑白胶片的加工条件来补偿互易失效，但对于彩色负片和透明胶片来说并非总是如此。大多数彩色胶片具有三个颜色敏感的染料层，每个颜色敏感的染料层具有略微不同的特征曲线位置和斜率，导致对互易效应的变化响应，可能引起不希望的颜色偏移或铸造。通常，在使用彩色胶片时，必须调整曝光时间和色彩平衡滤光片以补偿非常长或短的曝光。
利用具有非常小的数值孔径的物镜（例如，具有na = 0.65的40x物镜而不是具有0.85,0.95或1.0的na的相同放大物镜）产生显示亮度不足的图像，这导致更长的时间曝光时间。数值孔径是物镜聚光能力的量度，意味着高数值孔径物镜可以捕获更大量的发色团产生的弱荧光发射。在进行荧光显微照相时，始终使用可用的物镜数值孔径。使用过多的物镜和光电目镜放大也会导致亮度降低。为了弥补这一点，在给定的放大倍数下，始终采用尽可能低的放大率光学物镜和数值孔径物镜。例如，数值孔径为0.95（亮度指数= 22.6）的60x平面复消色差物镜优于数值孔径等于0.85（亮度指数= 14.5）的60x平面萤石物镜，即使萤石物镜的工作距离为复消色差的两倍。此外，由于高数值孔径物镜具有较浅的景深，因此它们的使用可以避免从焦平面上方或下方的离焦发射的对比度降低效应。同样，2.5x光镜将提供比3.3x或5x目镜更多的照明。
物镜亮度值物镜放大数值孔径（na）物镜亮度指数
10 0.25 3.9
10 0.30 8.1
10 0.45 41.0
10 0.50 62.5
20 0.40 6.4
20 0.50 15.6
20 0.75 79.1
40 0.65 11.1
40 0.75 19.8
40 0.95 50.9
40 1.00 62.5
40 1.30 178.5
60 0.85 14.5
60 0.95 22.6
60 1.40 106.7
100 1.25 24.4
100 1.40 38.4
表格1
细胞生物学和医学诊断等领域的典型荧光应用不仅涉及样本亮度，还涉及特定样本荧光与内在背景荧光的比率。这对于单分子荧光事件和其他低光实验尤为重要，其中物镜内部的自发荧光和/或内部反射在低荧光量子产率的小结构成像能力方面产生巨大差异。为了在荧光显微镜设计的物镜中大化信噪比（背景上的样品荧光强度），制造商使用石英和其他特殊玻璃配方，在从红外到紫外的整个光谱范围内具有高透射率。这些物镜在自发荧光方面极低，并利用特殊的光学水泥和抗反射涂层，设计用于扩展的荧光激发波长范围。与*玻璃配方相结合的更高数值孔径提供了现代荧光物镜，能够以低至340纳米的波长激发样品，具有更高的透射率，以获得更亮的荧光图像。
表1列出了常用放大倍率和数值孔径的标称物镜亮度值的比较。这些数字是根据下式计算的：
亮度指数=（na）4 /（放大率）2 ×透射比
其中na是物镜数值孔径和传动比假定为100,000。从该等式可以看出，对于相同的放大率，照明场和二次荧光的图像亮度随着物镜的数值孔径而增加，但是随着放大率的增加而减小。特定物镜的实际数值孔径和放大率值可以与标称值相差多达5-10％。如上所述，由物镜透射的亮度还取决于内部结构参数，例如玻璃透镜元件的数量，内部反射和眩光，以及透镜涂层。经常，
使用尽可能高的数值孔径聚光器和透射光荧光，以避免光线损失和伴随的长曝光时间。此外，在较旧的显微镜上使用子镜时，购买一个带有镀铝表面而不是镀银镜的镜子（银会很难反射紫外线）。通常，油浸暗场聚光镜可以代替用于透射荧光应用的标准明场聚光镜。使用浸油时，在聚光镜的顶部透镜和显微镜载玻片的下侧之间以及物镜前透镜和盖玻片之间涂抹非荧光油。这种油很容易从许多商业制造商处获得。
光漂白或染料光解会迅速降解用于染色样品的荧光探针，并应尽可能将制剂暴露在尽可能低的光照水平下。这种效应主要是由荧光染料和氧气之间的光动力学相互作用引起的，其涉及通过称为系统间交叉的过程将染料分子从单重基态促进到相对长寿命的三重态激发态。。一旦发色团升高到激发态，它就变得更具化学反应性，然后可以参与不可逆的化学反应，包括分解，聚合，氧化（主要通过单线态氧）或与另一个分子反应。与氧反应通常会引起发色团的漂白，这取决于细胞内单线态氧浓度和发色团与其他内部细胞组分如蛋白质，脂质或小分子的接近程度。计算表明单线态氧可以在超过500埃的距离上产生发色团光解。
为了大限度地减少光漂白的影响，荧光显微镜可以与其他对荧光染料无破坏性的技术相结合，如差分干涉对比度（dic），霍夫曼调制对比度（hmc），透射暗场照明和相位对比度。我们的想法是使用非破坏性对比增强技术在样本中定位感兴趣的特定区域，然后在不重新定位样本的情况下，将显微镜切换到荧光模式。这种类型的典型实验的结果示于图3和4中。图3（a）示出了使用相差光学器件成像的单层组织培养物中的3t3成纤维细胞。该细胞系由国立卫生研究院的瑞士小鼠胚胎细胞系建立，它们具有高度接触抑制作用，可用于涉及肉瘤病毒形成和白血病病毒繁殖的研究。图3（b）中的显微照片显示了相同的视野，但这次使用荧光照明（水银蒸汽灯和olympus wu滤光片立方体）成像，细胞被荧光染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色（dapi） ），核酸特异性染料，发射大值为461纳米，用于选择性染色细胞核和染色质。图3（c）说明组合使用的两种技术，以产生叠加在成纤维细胞膜和内部细胞器的相差图像上的荧光染色的3t3细胞核的美丽显微照片。
另一个组合技术的例子，这次使用差分干涉对比度（dic），如图4所示。图4（a）所示是猫脑组织的薄切片感染隐球菌并使用dic光学和全波成像延迟板。注意显微照片的伪三维外观。图4（b）显示了相同的视野，但是用荧光照明和olympus wib滤光片立方体成像。图4（b）中的细胞用荧光素-5-异硫氰酸酯（fitc）和刚果红（发射波长大值分别为520和614纳米）的组合染色。这两种技术组合使用以产生图4（c），其示出了荧光和dic照射中感染的猫脑组织。
光漂白的速率取决于若干因素，包括发色团的化学反应性，细胞内化学环境以及激发光的强度和波长。一些荧光染料容易受光漂白影响，而其他荧光染料相对不敏感并且在更长时间内稳定。在许多情况下，样品可以从光漂白的效果中恢复，特别是如果它保持凉爽并且在黑暗环境中。应将光漂白与另一种称为猝灭的荧光伪影区分开来这是通过在盐或卤素化合物存在下通过诸如温度，高氧浓度和分子聚集等竞争过程减少（或在某些情况下，增强）荧光强度而发生的。有时猝灭是由于能量转移到物理上靠近激发的荧光染料的其他受体分子，这种现象称为共振能量转移。这种特殊现象已成为测量远低于光学显微镜横向分辨率的距离的新技术的基础。发色团中的杂质还可以通过光漂白或猝灭来降低荧光强度。
通过减少曝光时间（如上所述）或通过降低激发能量（灯强度）可以使光漂白小化，然而这些补救措施伴随着降低发色团荧光发射能量的不良效果。中性密度滤光片可以在光到达激发滤光器之前放置在光路中，从而减小激发光强度并减少样品观察期间的褪色效应。许多荧光显微镜配备了一个与中性密度滤光片相连的快门系统，可以在观察和样品操作过程中降低激发光的强度，但是使显微镜能够轻松切换到全功率照明以进行显微摄影。在可能的情况下，它也很有用正丙基丙酮酸盐和其他抑制剂，可商购获得。能够淬灭单线态氧的化学物质也可用于降低光漂白的影响。实例是2-巯基乙胺，1,4-二氮杂双环-2,2,2-辛烷（dabco），二苯基异苯并呋喃，对苯二胺和氨基酸*。在某些情况下，通过改变封固介质的ph浓度，也可以减少褪色效应。
图5（a）说明了几种市售抗褪色试剂对荧光褪色速率的抑制作用。蓝色曲线显示未经处理的样品的荧光强度快速下降，而绿色和红色曲线显示两种效率略有不同的抗褪色试剂降低了褪色速率。标本是用荧光素-5-异硫氰酸酯（fitc）或罗丹明鬼笔环肽染色的有袋肾组织培养细胞（ptk2）（两种染料都具有相似的褪色特性）。抗褪色试剂是对苯二胺（绿色曲线）或n没食子酸丙酯（红色曲线）。样品二次荧光褪色率通常根据使用的荧光染料而不同，即使在相同条件下观察也是如此。通过选择具有与特定应用可用的褪色速度低的褪色速度的荧光染料，可以获得结果。该概念如图5（b）所示，其比较了三种荧光染料的有袋肾细胞褪色速度的差异：罗丹明（黄色曲线），花青染料cy3（红色曲线）和fitc（绿色曲线）。罗丹明是一种普遍存在的染料，具有多种应用，在这些条件下显示出非常慢的褪色速率（图5（b）;黄色曲线），并且是使用该系统进行显微摄影的荧光染料。
为了进一步减少褪色，建议在样品内的一个区域内进行初步观察，然后在曝光前快速移至“新鲜”区域。这种做法可能有助于规避漂白和/或褪色效果。在部分黑暗的室内环境中进行观察和显微照相也是有帮助的。虽然化学方法和仔细的显微镜检查可以减少光漂白，但效的方法是使用专为荧光显微镜设计的低光照级ccd数码相机，提高检测灵敏度（加上激发能量降低）。
光漂白的发生导致了一种称为frap的技术，frap是光漂白后荧光恢复的首字母缩写。该技术基于短激光爆发的漂白和随后观察由荧光染料扩散到漂白区域引起的荧光恢复。
屏障滤光片设计用于吸收从样品反射或透射的特定波长的激发辐射，并仅透射所选择的可见光荧光。屏障滤光片的截止波长范围是至关重要的，因为在许多情况下，它必须能够透射与用于照射样品的激发光相差不大的可见波长。由于薄膜对380-450纳米区域的紫外和可见波长非常敏感，因此屏障滤光器阻挡该范围内的所有不需要的波长尤为重要。为确保去除较短波长，应在光路中添加额外的紫外线阻挡滤光片，如柯达wratten滤光片编号2a，2b或2e。所有这些滤光片都*吸收紫外线，但它们对低波长可见蓝光的吸收有轻微差别。应在光路中的主屏障滤光片之前放置辅助紫外线滤光片，以阻挡可能在主屏障滤光片中引起自发荧光的辐射，特别是如果此滤光片为黄色，橙色或红色。如果屏障滤光片在太长的波长处切割光谱，则样品荧光颜色将受到影响并且图像的强度可能受损，尤其是当仅通过滤光器通过透射荧光的长波长部分时。应在光路中的主屏障滤光片之前放置辅助紫外线滤光片，以阻挡可能在主屏障滤光片中引起自发荧光的辐射，特别是如果此滤光片为黄色，橙色或红色。如果屏障滤光片在太长的波长处切割光谱，则样品荧光颜色将受到影响并且图像的强度可能受损，尤其是当仅通过滤光器通过透射荧光的长波长部分时。应在光路中的主屏障滤光片之前放置辅助紫外线滤光片，以阻挡可能在主屏障滤光片中引起自发荧光的辐射，特别是如果此滤光片为黄色，橙色或红色。如果屏障滤光片在太长的波长处切割光谱，则样品荧光颜色将受到影响并且图像的强度可能受损，尤其是当仅通过滤光器通过透射荧光的长波长部分时。
荧光显微照相中的色彩平衡误差可能有许多起源。图6中显示的显微照片说明了在荧光照射下成像样品时由自发荧光和不适当过滤引起的颜色降解所引起的几个问题。标本是在组织培养中生长的单层成纤维细胞，并用7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（amca）染色，amca是一种明亮的紫外线可激发染料共轭物，发射波长大值为445纳米（简称 - 波长蓝色区域）。amca的激发波长为345纳米，这需要通过大量紫外光的激发滤光器。在适当的照明和过滤条件下，如图6（b）所示，染色的样本出现细胞核和细胞质成分染成丰富的深蓝色（用olympus wu滤光片立方体成像）。当使用穿过太多紫外光的屏障过滤器时，在样品的显微照片中经常出现蓝色和背景颜色（如图6（a）所示），并且二次荧光颜色降低。在显微镜光学路径中的某处放置辅助紫外和/或短蓝色波长屏障滤光器是用于缓解该问题的选择方法。和二次荧光颜色降低。在显微镜光学路径中的某处放置辅助紫外和/或短蓝色波长屏障滤光器是用于缓解该问题的选择方法。和二次荧光颜色降低。在显微镜光学路径中的某处放置辅助紫外和/或短蓝色波长屏障滤光器是用于缓解该问题的选择方法。
用于染色样本的荧光染料经常产生不希望量的短波长蓝色自发荧光，特别是在染色组织切片时。如上所述，这种自发荧光必须被屏障过滤器吸收，以避免由荧光染料标记的标本产生的二次荧光发射的降解。柯达wratten滤光片2a和2e吸收短波长蓝光辐射，适用于此应用。显微镜制造商和售后市场供应商也提供有助于微调屏障过滤器截止范围的过滤器。
安装介质中的内在自发荧光也可能导致与图6（a）所示的显微照片相关的问题类型。许多流行的性固定介质制剂表现出自发荧光作为不希望的副作用，不应用于定量荧光工作。相反，应使用纯甘油，甘油 - 水混合物或无荧光浸油制成的临时支架来制备样品。显微镜制造商提供专门的物镜，通过光学校正甘油中的样品观察。通过安装介质产生的自发荧光通常是淡蓝色或绿色，并且将导致样品的二次荧光降解。如果屏障过滤器不能去除安装介质产生的多余自发荧光，有时可以在路径中添加柯达wratten颜色补偿滤光片以缓解此问题。大多数介质产生的淡蓝色可以通过使用cc20y（黄色）等滤光片去除，浅绿色荧光可以用cc20m（品红色）滤光片中和。使用更高密度的滤光片（cc30及以上）通常会导致二次荧光的吸收。
细胞和组织在培养物中表现出的自发荧光通常会限制在染色和固定制剂中检测荧光探针的能力。固定组织显示的自发荧光的程度通常根据样品制备和用于检测荧光的实验条件而变化。黄素辅酶（fad和fmn）和还原的吡啶核苷酸（nadh）是哺乳动物细胞中自发荧光的主要来源。荧光染料染色的植物细胞中的二次荧光经常被来自木质素（绿色自发荧光）和卟啉（例如叶绿素）（红色自发荧光）的自发荧光掩盖。在染色之前，通过用磷酸钠缓冲盐水中的0.1％溶液*洗涤30分钟，有时可以用固定的细胞和组织克服该问题。
当激发和/或发射滤光片与用于染色样品的发色团的波长吸收和发射光谱不匹配时，二次荧光通常会受到损害，如图6（c）所示。在该示例中，使用具有太短波长截止的不适当发射滤波器来传递由样本发射的二次荧光。因为这种荧光的大部分集中在光谱的蓝色区域（455纳米），所以滤光器仅通过泥红色的长波长色调。要纠正问题，应选择新的屏障过滤器。彩色胶片的过度曝光以及互易误差也会导致终图像中二次荧光的显着色移。
当显微镜光学系统配置错误或使用错误的滤光器组合时，荧光显微镜中经常出现对比度误差。图7中显示了这些误差中的一些，其说明了由不适当的激发滤光器选择和荧光浸渍油引起的二次荧光图像中的对比度差。标本是日本枫叶叶柄的横截面，其经历自发荧光并使用olympus wbv过滤器立方体用10x萤石物镜成像。在理想条件下，将获得图7（b）中呈现的图像。然而，当激发滤光器具有太大的带宽（允许不需要的波长通过）时，图像会失去对比度，从而产生图7（a）所示的显微照片。选择正确的滤光片组合需要知道用于染色样品的发色团的激发和发射的光谱值。在这种情况下，激发滤光片通过高达550纳米的波长，干扰样品发出的绿色二次荧光，严重影响图像对比度。
在荧光显微镜中控制样品对比度要求显微镜的所有光学组件都没有自发荧光，并且它们不应该在很大程度上散射光。这包括内部玻璃透镜元件，镜子，滤光器和分束器。物镜应提供高图像质量，同时将高效率的光传输到近紫外范围。滤光片必须传输所需的波长，同时阻挡可能干扰二次荧光观察的其他波长。因为激发光的强度比样本荧光强得多，从荧光图像中*去除这种光的任务不是很容易，并且需要仔细选择提供窄范围激发波长（通常在10到75纳米带宽内）的滤光器组合。当使用高数值孔径浸没物镜时，浸油必须没有可能表现出荧光的污染物。图7（c）示出了浸没油中自发荧光产生的不良对比度的实例。虽然浸油的使用有助于提高图像亮度，部分是通过消除表面反射（特别是盖玻片和玻璃镜片元件）引起的错误光线的损失，诱发自发荧光的荧光污染物将不需要的波长与来自样品。
样本制备中的伪像也会在荧光显微镜中产生对比度问题。荧光的早期经常使用非特异性荧光染料，由于染料分子随机散布在整个样品中，因此产生非常明亮的图像。具有改进的和高度特异性的荧光染料的较新的荧光技术已经导致样品显示出染色的靶区域具有基本上较弱的荧光，因为粘合的染料少得多。这些较新的方法需要更仔细的样品制备，以避免不必要的荧光伪影。用非荧光染料对部分样品进行预染色通常是有帮助的，这些染料竞争结合位点以帮助荧光染料选择性。在将样品放置在用非荧光玻璃制成的酸洗显微镜载玻片上之前，应*清洗样品以去除未结合的荧光染料。通过添加化学添加剂以小化光漂白来优化荧光染料环境有助于减少或消除样品褪色。此外，仔细选择封固剂的化学成分和ph值对于从二次荧光中获得图像非常重要。如上所述，盖玻片和浸油也应该是非荧光的。仔细选择封固剂的化学成分和ph值对于从二次荧光中获得图像非常重要。如上所述，盖玻片和浸油也应该是非荧光的。仔细选择封固剂的化学成分和ph值对于从二次荧光中获得图像非常重要。如上所述，盖玻片和浸油也应该是非荧光的。
由于样品的固有性质或染色错误，可能发生自发荧光和/或非特异性荧光。这种类型的典型错误如图8（a）所示，其显示用荧光素-5-异硫氰酸酯（fitc）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）的混合物染色的大鼠结肠组织的薄切片。 。显微照片中的整体蓝色投射是由于dapi荧光染料的过度染色导致的自发荧光和非特异性荧光的组合。用两种染料进行适当染色，然后*洗涤样品，得到图8（b）所示的显微照片。类似于图8（a）所示的错误也是由于使用太宽的激励带宽引起的，一个可逆的错误，可以通过使用带宽较窄的滤波器来纠正。或者，可以采用激发滤光器的组合来选择性地产生一组特定的波长，或者可以调节屏障滤光器以仅通过更长的波长。图8（c）示出了当正确染色时的大鼠结肠薄切片，但现在由于光学路径中缺少红色抑制滤光器而导致浅红色背景。通过在光路中放置适当的抑制滤波器可以纠正此错误。图8（c）示出了当正确染色时的大鼠结肠薄切片，但现在由于光学路径中缺少红色抑制滤光器而导致浅红色背景。通过在光路中放置适当的抑制滤波器可以纠正此错误。图8（c）示出了当正确染色时的大鼠结肠薄切片，但现在由于光学路径中缺少红色抑制滤光器而导致浅红色背景。通过在光路中放置适当的抑制滤波器可以纠正此错误。
荧光显微照相术也遇到其他形式的光学显微镜和显微照相术遇到的常见问题。这些包括由光学元件和胶片平面之间的焦距调节不当引起的聚焦误差，显微镜支架振动，污垢和碎片污染，曝光不足，曝光过度，色彩平衡错误，镜面反射（长时间曝光和头顶房间照明常见），渐晕和光学显微镜未对准。这些错误的实例在olympus显微镜资源中心显微镜入门的显微照相部分的标题为荧光显微照片错误和颜色透明薄膜的部分中给出。
用于荧光显微照相的相机和胶片 - 胶片技术的改进提高了胶片速度和分辨率，但目前还没有适用于荧光显微照相的彩色胶片。各个彩色薄膜的特定性质，包括各个乳剂层的特性曲线，耦合染料的性质，以及用于荧光激发和发射的光的光谱响应通常在不同薄膜之间变化很大，并且有时难以控制和再现。这些问题导致难以使用胶片保持准确的显色和曝光以及彩色显微照相。
荧光显微照片中的曝光测量由于荧光样品内的亮度范围通常远大于可准确记录在胶片上的事实而变得复杂。高光的过度曝光将导致精细细节和色彩饱和度的损失，而曝光不足会产生非常暗的图像，这些图像不会显示隐藏在阴影区域中的特征。背景通常非常暗或黑，对于过度曝光或曝光不足都不是至关重要的。使用荧光时，使用三种主要方法来确定曝光：使用ccd，光电二极管或光电倍增管进行亮度测量，曝光期间的连续测量（光电倍增管），以及不理想的方法，试验和误差。设计用于荧光的现代显微摄影系统具有测量照明强度并基于该读数计算曝光时间的能力。对于常规荧光显微照相，一些相机具有用于确定曝光持续时间的硅蓝检测器单元，而其他相机具有用于测量极微弱样本的光电倍增管计量检测器。
涂膜性能iso编号光敏感度解析度晶粒尺寸暴露容忍度
25-50 低 高 精细 宽
100-200 介质 介质 介质 介质
400+ 高 低 粗 低
表2
在选择用于荧光显微照相的检测器系统时考虑几个因素是很重要的。这些包括探测器的噪声水平和图像的信噪比，空间和时间分辨率，几何失真，线性和光谱灵敏度。在确定荧光标本的适当曝光时，使用具有ccd或光电倍增管计量系统的摄像机，以便进行精确的低光测量。点测量能力对于测量实际发荧光的区域是有价值的，而不是对发荧光材料周围的通常深色背景的不希望的计量。另一种技术涉及使用曝光调节控制来减少曝光时间，否则通过测量视场的暗背景会过度延长曝光时间。在这方面，奥林巴斯和尼康提供的相机系统具有内置算法，可在相机设置为荧光模式时减少曝光。当光线不足时（通常大部分时间都是荧光），设置三目棱镜将所有光线发送到胶片平面，以减少曝光时间。
理想情况下，应该在显微照相系统中包括一个点测量仪，以帮助确定在暗背景下只能看到几个明亮物体时的曝光。对于在没有点测光计的情况下在整个视场上进行的集成光测量，曝光时间应减少一半或四分之一的计量读数（对于深色背景上的散射荧光物体），非常类似于暗视野显微镜的情况。如果点测光传感器位于视场中间的固定位置，则必须首先将样本移动到场的中心以获得适合曝光测量的区域，然后重新定位以构成显微照片。相机系统允许平板仪表传感器的平移，以使显微镜技师能够在曝光测量之前确定显微照片组成。在定位用于显微照相的样本之后，然后可以将点测量仪传感器移动到视野中亮的区域以进行曝光测量而不会干扰样本。使用点测光表时，确保荧光物体足够大以填充光斑并记录准确的曝光读数。
一些显微摄影相机系统提供分束器组件，其将一部分光引导至光度计，其允许在实际曝光期间进行光测量以补偿褪色。这是一种方便的方法，用于在运行中调整曝光时间以避免光漂白伪影，但它具有降低指向胶片的光强度的缺点，需要更长时间的曝光。更*的计算机辅助摄像系统能够通过方便存储在计量系统存储器中的预编程查找表来补偿互易性故障和衰落。通过相机系统计算机的互易故障的自动校正通过将以下等式应用于曝光计算来操作：
t c =（t m）p
其中tc是校正曝光时间，tm是计量（未校正）时间，p是根据系统查找表中容纳的各个薄膜的互易值确定的常数。该系统受到在计量系统的初始编程期间添加到查找表的胶片的互易数据的数量和类型的限制。
如果没有完整的曝光测光系统，必须通过跟踪和误差确定曝光时间。该方法涉及在各种曝光时间下进行一系列试验曝光，逐步增加一半到一个完整的光圈（包围）。处理完胶片后，会仔细记录产生效果的曝光，并为使用相同显微镜配置的进一步显微照相提供基础。样品照明或显微镜设置的改变将需要另一系列曝光支架来确定新的曝光时间。如果仅改变物镜放大率，则可以从先前记录的括号数据计算新的曝光时间。许多进行荧光显微镜检查的显微摄影师将其曝光时间上下三次或更多次，确保他们能够确保在其中一个设置下获得正确的曝光。保持良好的曝光记录和相关设备数据可以减少或消除对未来包围的需求。当使用试错法确定曝光时，明智的做法是连续监视显微镜灯输出，以确定灯老化时发生的照明偏差。使用这种曝光测定方法的显微镜专家通常依靠slr相机来捕获具有荧光照明的图像。使用这些相机，在曝光期间快门和取景器镜的移动可能会导致振动，从而导致图像不清晰。在进行曝光之前，通常可以通过使用遥控快门开关和/或升高镜子来避免这个问题。在某些相机中，自拍的操作会释放镜子.
专门用于荧光照明的显微镜通常在系统或聚焦望远镜中具有发光的掩模版，这允许显微镜师可视化叠加在非常暗的背景上的微弱可见标本上的显微摄影光栅。奥林巴斯和尼康都在其显微镜中提供标线，提供可选择的十字线和胶片框架颜色，以便观察样品。显微镜师可以选择红色或黄色照明的光罩。红色掩模版具有保持观察者眼睛的暗适应性的优点，并且当在蓝色和绿色二次荧光上观察时提供优异的对比度。对于红色荧光，当使用同时相位对比或dic时，应选择黄色标线以大化对比度。
选择用于荧光显微照相的胶片时，胶片速度（asa或iso等级）是一个应该仔细考虑的变量。iso等级越高，其他条件相同，在胶片上注册满意图像所需的光量就越少。荧光显微镜中使用的照明光源需要日光平衡的薄膜乳液，以准确地呈现样品的二次荧光颜色。大多数主要电影制造商提供各种iso透明度和彩色负片格式的日光胶片。标准为200或400或kodachrome 200的柯达日光ektachrome，均为35毫米，均为正透明胶片，具有足够的速度，良好的色彩再现和可接受的分辨率。fujichrome provia提供400和1600 iso等级，并且在色彩饱和度和分辨率方面是一款出色的透明胶片。其他制造商生产相当的透明胶片，但我们建议尽可能避免使用彩色底片。
对于黑白胶片，柯达提供t-max 400，这是一种优质的中等粒度胶片，是荧光应用的之一。有几种黑白胶片可以使用标准颜色负面化学品（c41）加工。其中包括kodak t-max 400cn，kodak advantix和ilford xp-2 super，所有这些都提供iso等级400.请记住，更快的胶片可以缩短曝光时间，但会增加粒度。表2列出了基本的薄膜特性供参考。
对比度是荧光显微照相术中的问题之一，它不仅取决于显微镜的配置，还取决于所选薄膜的物理特性，显影过程，曝光细节和样品本身与荧光染料染色效率的关系。和光漂白或褪色。彩色透明胶片可以通过一个或多个f-stop曝光不足（考虑互惠和褪色时的奖励），然后按通过延长显影剂中的处理时间来处理，以增加对比度和颜色饱和度。许多黑白胶片会产生对比度的变化，这取决于显影剂的混合条件和处理时间。荧光显微照相中胶片的分辨率主要由显微镜的光学参数（主要是物镜数值孔径）和配置的程度决定，但也在某种程度上取决于胶片特性和显影方法。然而，在实践中，当显微镜没有达到性能或者iso速度太高而谷物成为一个因素时，胶片分辨率才成为一个因素。
数字成像技术的进展已经*改变了使用电荷耦合器件（ccd）的显微照片的捕获。当对多重染色的荧光标本进行成像时，数码相机提供了出色的解决方案，并迅速成为许多显微摄影师的媒介。三芯片集成彩色ccd相机的价格已降至可承受的范围，当与帧抓取器或数字视频卡和计算机相连时，提供了一种收集，数字化，编辑和存储荧光图像的出色方法。
许多样品显示的弱荧光需要ccd检测器规格的高性能。目前，的选择是背面变薄的框架或行间转移装置，其配备有散热器和/或用于冷却的外部储存器。这些相机中的许多具有接近或超过90％的量子效率并且允许在读出之前顺序获取若干图像。图像采集周期从1秒到5秒不等，具体取决于读出速率，视频捕获参数和ccd分辨率。符合这些规格的典型ccd相机是optronics magnafire数码成像相机系统专为科学应用而设计。这款相机采用sony icx085al 2/3英寸行间传输ccd，阵列尺寸为1300×1030，像素尺寸为6.7微米。60 db动态范围和信噪比，24位，32位或48位色的文件位深度，每像素4个电子的暗电流，16,000电子阱深度，以及相机性能得到增强密封气体peltier ccd冷却。通过多个二向色光学玻璃滤色器形成彩色图像。optronics和其他制造商还提供各种数码相机（图9中所示的典型ccd相机），几乎适用于荧光和常规光学显微镜的所有需求。
以下几点总结了荧光显微照相的重要方面。
使用高数值孔径物镜，配备对近紫外光透明的玻璃或石英镜头。也可以使用低放大率的投影镜头来限制总放大率。
反射光荧光优于透射光荧光。如果无法将显微镜配置为反射光，请使用透射光暗视场聚光镜。
通过仔细选择胶片参数，适当的显微镜配置，并通过仔细匹配发色团激发和二次荧光特性与适当的激发和屏障过滤器来优化样品对比度。
从光路中移除三目分束棱镜，使100％的光在曝光期间到达胶片平面。也使用35毫米胶片，避免更大的胶片格式。
选择日光平衡透明胶片，以获得的样品颜色，分辨率和对比度。推动工艺透明胶片以增强对比度和色彩饱和度。
光源必须在非常窄的光谱范围内提供高强度辐射，通常在10到50纳米之间。选择是氙气和汞蒸汽灯或调谐到特定波长的激光。
显微镜光学系列，包括透镜，镜子，滤光片，分光镜，浸没介质，显微镜载玻片和盖玻片，应该没有自动荧光组件。
在不查看或拍摄荧光样本时，使用照明器中的滤光片滑块或快门阻挡激发光，以避免光漂白导致样品损坏。
始终在照明器和荧光滤光片之间提供一个热过滤器，过热可能会损坏热过滤器。
监视灯泡是否有闪烁迹象，并在照明强度变得不均匀时更换。保持灯泡和垂直照明器的调节，以确保适当的köhler照明。
仔细准备标本，并在染色后*清洗去除多余的发色团。
总之，荧光显微镜领域正在许多医学和生物学研究实验室中迅速扩大。荧光显微镜的主流已经经历了从利用透射光到入射光的几乎*转变，伴随着许多新的和不同的荧光染料的引入。这是推动许多新的和变化的荧光显微镜应用的推动力。