通过 sfc-uv/ms 分离西红花主要提取物
西红花，又称藏红花，是世界上昂贵的香料之一，其花朵呈现一种精致的紫色色调，内部的丝状红色柱头非常珍贵。在秋天，红色柱头通过手工采摘并分离，生产一磅(0.45公斤)的西红花柱头需要7万朵花。这些红色柱头可以用作香料、染料并且具有药用价值。
▲图1：西红花花朵与柱头
西红花内有非常多的提取物，主要成分为西红花苷、苦番红花素、西红花酸等。其中许多化合物有被广泛认同的药理活性， 比如西红花苷在治疗心血管疾病方面具有一定的作用。
西红花苷存在于西红花及栀子属植物中，比较常见的分离法是采用高压液相色谱法（hplc），c-18色谱柱，流动相为水/乙腈或水/甲醇体系。初始梯度为高含水量，有机溶剂含量随时间而增加，以洗脱非极性化合物，分离过程中也会加入甲酸以改善峰型。[2-6]
栀子类药材中西红花苷类成分的定性定量分析：
▲图2：a.混合对照品；b.栀子；c.水栀子的 hplc 分离图
西红花苷ⅰ 5. 西红花苷ⅱ 8. 西红花苷ⅳ 17. 西红花苷ⅲ
acchrom xcharge c18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈（a）和0.1%甲酸水溶液（b），梯度洗脱，洗脱程序为：0～15min，22% a；15～30min，22%～25% a；30～35min，25%～28% a；35～50min，28% a；50～72min，28%～45% a；72～85min，45%～55% a；流速1ml·min-1，柱温30℃，检测波长440 nm，进样体积10μl。
本文介绍了一种利用buchi sepiatec sfc-50分离西红花柱头主要提取物的方法。sfc-50内置紫外检测器并与ms（质谱检测器）相连，从而判断峰物质。
▲图3：sepiatec sfc-uv/ms系统
1 实验条件
设备
sepiatec sfc-50(uv/ms)
色谱柱
nucleodur nh2 5μm 250 x 4 mm
流动相种类
a=co2 ;b=甲醇
流动相条件
平衡色谱柱5分钟
0-1 min: 14 % b
1-18 min: 14-18 % b
18-40 min: 18-50 % b
40-44 min: 50 % b
流速
7 ml/min
紫外检测器
440 nm
mass 检测器
esi (+/-)
背压
150 bar
柱温
40 ℃
样品
1000mg 西红花柱头 10ml 热甲醇提取物
进样量
100 ul
2 结果与讨论
▲图4：西红花提取物在紫外波长440nm下的分离图
用甲醇对西红花柱头的主要成分进行了提取后，得到的多数为极性化合物。图4为紫外波长 440nm 下的分离图。在前18分钟，由于流动相为弱极性(86- 82% co2)，紫外检测器下无化合物被洗脱下来。当流动相的极性通过梯度增加时，几种极性化合物被依次洗脱。其中的主要提取物西红花酸易与几种糖(葡萄糖、龙胆二糖和三氯蔗糖)结合形成西红花苷。因为西红花酸与糖分子的共价键导致了极性的强烈增加，并使西红花苷具有亲水性，所以在氨基柱上的分离出峰时间比较晚[7-9]。
在质谱检测上，我们使用电喷雾离子源（esi），这是一种常压下的温和电离方法，可以在正离子(esi+)或负离子(esi-)下进行。在正离子模式下，通常会形成钠加合物([m+na]+)或质子加合物([m+h]+)。在负离子模式下，([m-h]-)离子通常是由于失去一个质子而形成的。根据样品及其性质的不同，也可以形成多种带电产物。
▲图5：(a) uv-440 nm;(b) mass 999-999.5 (esi+);(c) mass 836.9-837.4 (esi+);(d) mass 674.8-675.3 (esi+);(e) mass 975.5- 976 (esi-);(f) mass 813.4-813.9 (esi-);(g) mass 651.4-651.9 (esi-);(h) mass 341.2-341.7 (esi-)
▲图6：西红花苷ⅰ(a) esi+ and (b) esi-, 西红花苷ⅱ(c) esi+ and (d) esi-, 西红花苷ⅲ (e) esi+ and (f) esi- 以及西红花酸单甲酯(g)esi-的质谱图
图5与图6展示了西红花甲醇提取物通过 sepiatec sfc-50 结合 ms 检测器后的分离图谱，信号基于不同的 m/z（质子数/电荷数）。根据质谱结果我们可以推断出表1的结构式结果。
no.
化合物名称
结构式
m/z
1
西红花苷ⅰ
976.4
c44h64o24
2
西红花苷ⅱ
814.8
c38h54o19
3
西红花苷ⅲ
652.7
c32h44o14
4
西红花酸单甲酯
342.4
c21h26o4
▲表1：根据图5推断的西红花主要提取物的结构式和摩尔m/z
西红花苷ⅰ是由西红花酸和两个龙胆二糖分子组成。在图5中，该化合物 esi+ 模式下的检测 m/z 为 999-999.5，其加合物由钠(m/z 23 g/mol)和样品分子(m/z 976.4 g/mol)组成。在 esi- 模式下也可以检测到西红花苷ⅰm/z 为975.5-976。其对应的图6质谱图为(a)与(b)。
西红花苷ⅱ由西红花酸、葡萄糖和龙胆二糖分子组成。在 esi+ 模式(图5(c))和 esi- 模式(图5(f))下，分别为(m/z 836.9-837.4[m+na]+)和(m/z 813.4-813.9[m- h]-)。其对应的图6质谱图为(c)与(d)。
西红花苷ⅲ在 esi+ 模式(图5(d))和 esi- 模式(图5(g))下，分别为(m/z 674.8-675.3[m+na]+)和(m/z 651.4-651.9[m-h]-)。其对应的图6质谱图为(e)与(f)。
西红花酸单甲酯只能在 esi- 模式(图5(h))下鉴别，m/z为341.2-341.7[m-h]-。其对应的图6质谱图为(g)。
在 esi 过程中，样品分子会被碎片化，特别是在 esi- 模式中。例如，西红花苷ⅰ和西红花苷ⅱ上的葡萄糖基团在esi-模式下的脱离，导致其在图5(g) m/z 651.4-651.9[m-h]- 中也被鉴定出来。
3 结论
sepiatec sfc-50 可以有效分离西红花柱头内结构相似的提取物，为了鉴别里面的未知成分，采用 sfc-uv/ms 结合的形式，适用于多数天然产物应用。相比 hplc 的流动相，超临界二氧化碳具有高扩散系数和低粘度的特点，并且得益于二氧化碳的弱酸性，无需加入甲酸也能获得不错的峰型。在选择性上，由于 sfc 属于正相色谱，在出峰顺序和时间上与传统的 rp-lc 不同，这使得 sfc 在分离一些化合物组分时具备出峰时间上的优势。比如本次分离中的西红花苷ⅲ，在图2的 rp-lc 中，出峰顺序靠后，时间在 60 分钟之后；而在图5的 sfc 中，其出峰顺序靠前，时间在 28-29 分钟。这在分离一些极性偏弱的化合物时可以节省很多时间。
4 参考
doi: 10.13140/rg.2.2.19634.40649
dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.06.090
doi: 10.1081/fri-100100281
doi: 10.1016/j.foodchem.2005.11.020
doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113094
叶潇，张东，冯伟红，梁曜华，刘晓谦，李春，王智民．栀子类药材中西红花苷类成分的定性定量分析[j/ol]．中国中药杂志.
doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20220214.301
doi.org/10.1021/acs.jafc.5b03194
doi.org/10.1073/pnas.140462911
doi: 10.1007/s00425-004-1299-1