1.将两种寡核苷酸各1μg加入微量离心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min，然后在合适的退火温度下保温5 min，取2 μl 留待以后的分析。
2.加2μl 4种dntp混合液和10u测序酶，30℃温育30min。
3.70℃ 10min 灭活dna聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。
4.加10×限制性内切酶反应缓冲液，加水和20——100 u 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h以上。
5.酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl的无水乙醇，-70℃沉淀15 min，离心5 min，沉淀重悬于100 μl te缓冲液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，20 μl te缓冲液溶解，取2 μl用于以后的分析。
6.用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物，估计延伸的寡核苷酸的量，再用适当的载体亚克隆。
7.对几个合适的亚克隆测序。