细胞分选常见问题
问题一
为什么建议磁珠分选而不是流式分选？
1)磁珠分选需要的设备简单，而流式分选需要配备分选型流式细胞仪，价格较为昂贵，而且流式分选对于操作员的技术要求很高，需要专门的培训并有一定的经验后才能很好地完成流式分选；
2)磁珠分选所需要的时间远小于流式分选所需要的时间；
3)磁珠分选对于目的细胞的刺激比流式分选要小，流式分选过程中需要对目的细胞所在的液滴通电，并且需要经过一个强电场的区域，对目的细胞的刺激相对较大；磁珠分选只是让细胞处于一个低磁场中，基本可以忽略对细胞的影响，从保持细胞活力的方面考虑，磁珠分选要优于流式分选。
因此，如果磁珠分选可以满足实验需求时，应尽量选择磁珠分选的方法。
问题二
磁珠分选为什么要求细胞活性越高越好？
1)死细胞分泌dna，dna有粘性，会将磁珠标记细胞和非标记细胞粘在一起，如果是阳选会影响纯度，如果是阴选会影响得率。
2)细胞活性低时可能会影响抗原抗体的结合效率。
问题三
磁珠分选buffer是什么？
automacs running buffer（自己配制：ph7.2 pbs，0.5％bsa、2mm edta，如需无菌，建议购买商品化buffer或紫外线照射，不建议高温高压灭菌）。
问题四
如果想分选的细胞有多个阳性marker怎么办？
可以选择磁珠分选阴选+阳选的方法，eg.分选小鼠脾脏naive cd4+t可以先用阴选的方法分到cd4+t细胞再用cd62l磁珠阳性分选；也可以用磁珠+流式的方法。
问题五
分选柱可以二次使用吗？
不建议，主要是分选柱内填充的铁珠在使用后易生锈。
问题六
分选柱应如何选择？
不同的试剂盒对于ms/ls/ld柱的最大细胞上样量和最大磁性细胞吸附量是不同的，建议一定要参考说明书；
此外，如分选的目的细胞较大（eg.巨核细胞或fibroblast），可考虑采用large cell colums。
磁珠分选-方案a：magnisort™阳性分选
引言
下述方案是magnisort™阳性分选试剂盒的通用操作指南。具体请参见试剂盒内的说明书。在阳性分选中，待分选的细胞首先与标记的抗体结合，然后被链酶亲合素包被的磁珠捕获。将细胞放入magnisort™磁座后，阳性细胞被磁场吸住，而阴性细胞仍游离在溶液中，可被弃掉。每个试剂盒中的化抗体和磁珠预先已滴定好最适浓度，为即用型试剂。
注意事项
注：magnisort™5ml磁座可产生强磁场。应远离心脏起搏器、、磁性身份卡、手表、计算机显示器、硬盘等物品，以免损坏。
细胞制备
1.在未特别说明的情况下，magnisort™阳性分选试剂盒已优化，适用于小鼠二级淋巴组织或正常人pbmc。
2.用于小鼠细胞时，建议用40μm的尼龙细胞筛清除碎屑，以使试剂盒发挥出最佳效果。
3.正常人pbmc的制备，参见“细胞制备-方案d：从全血中提取pbmc”（第28页）。为使magnisort™试剂盒发挥最佳性能，建议洗涤白膜层，去除血小板。
4.向缓冲液中加入edta减少细胞聚集。
后续用于无菌培养
1. magnisort™阳性分选抗体和阳性分选磁珠中含有少量作为防腐剂。当使用不含的无菌缓冲液时，它不会影响细胞功能。需要根据测试判断在特定实验中的性能。
2.分选无菌细胞时应该在超净工作台中进行，并使用带盖的聚苯乙烯无菌试管和无菌缓冲液。
提供的材料
ƒmagnisort™阳性分选抗体，200次试验，20μl/次试验。2-8°c贮存。
ƒmagnisort™阳性分选磁珠，4ml。2-8°c贮存。
所需其他材料
ƒ细胞分选推荐使用的缓冲液：添加3%胎牛血清（fbs）和10mmedta的pbs或hank（hbss）。2-8°c贮存。
ƒmagnisort™磁座，5ml。
ƒ12 x 75 mm流式管(5 ml，bd falcon™，货号352008或类似产品)。
ƒ15ml离心管(bd falcon™，货号352099或类似产品)
实验步骤
1.用适当的细胞分离液，制备浓度为1x107细胞/100μl（1 x 108/ml）的淋巴细胞悬液。
注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。
2.将所需数量的细胞（不能超过2 x 108个细胞）放入12 x 75 mm的5ml试管中。
3.每100μl细胞中加入20μlmagnisort™阳性分选抗体。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。
4.加入细胞分离液洗涤细胞，使其总体积达到4ml，在300xg下离心5分钟。
5.弃上清，然后用细胞分离液重悬细胞至最初的体积。
注：细胞必须制成单细胞悬液，实验前需要检查样本，必要时用涡旋或移液器去除细胞团块。
6.每100μl细胞中加入20μlmagnisort™阳性分选磁珠。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。
注：为确保最佳性能，将magnisort™阳性分选磁珠加入细胞之前必须充分混匀。将设定为1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打5次，或者采用涡旋的方式重悬磁珠。7.用细胞分离液将体积加至2.5ml。将设定为1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混匀。不能涡旋。
8.将试管插入磁座中间的孔底，室温孵育5分钟。
9.拿起磁座将试管内的上清液倒入废液容器内；这些是不需要（未结合）的细胞。将试管倒置1秒钟，然后回正。注：切勿吸干或摇晃倒置后的试管，否则会降低回收率。如果需要也可以收集起结合细胞。
10.从磁座中取出试管并重复7-9步两次，总共洗涤细胞3次。
11.从磁座中取出含目标细胞的试管，加入1ml细胞分离液。沿着试管侧壁加入缓冲液，洗涤试管侧壁。此时，试管内就是分选的阳性细胞，备用。
磁珠分选-方案b：magnisort™阴性分选
简介
以下是magnisort™阴选试剂盒的通用操作指南，该试剂盒适用于细胞进行阴性分选。具体请参见每个试剂盒内的说明书。在阴性分选中，不需要的细胞与bition化抗体混合液结合，然后加入链霉亲和素包被的磁珠。将细胞放入magnisort™磁座后，不需要的细胞被磁场吸住，而需要的细胞游离在溶液中，将其倒出后即可使用。每个试剂盒中的ition化抗体和磁珠已预先滴定好最适浓度，为即用型试剂。
注意事项
注意：magnisort™5ml磁座可产生强磁场。应远离心脏起搏器磁性身份卡、手表、计算机显示器、硬盘等物品，以免损坏。
细胞制备
1.在未特别指明的情况下，magnisort™阴选试剂盒已经过优化，专门适用于小鼠二级淋巴组织或正常人pbmc。
2.用于小鼠细胞时，建议用40μm的尼龙细胞筛清除碎屑，以使试剂盒发挥出最佳效果。
3.正常人pbmc的制备，参见“细胞制备-方案d：从全血中提取pbmc”（第28页）。为使magnisort™试剂盒发挥最佳性能，建议洗涤白膜层，去除血小板。
4.缓冲液中加入edta减少细胞聚集。
后续用于无菌培养
1. magnisort™阴选抗体混合液和阴性分选磁珠中含有少量作为防腐剂。当使用不含的无菌缓冲液时，它不会影响细胞功能。需要根据测试判断在特定实验中的性能。
2.分选无菌细胞时应该在超净工作台中进行，并使用带盖的聚苯乙烯无菌试管和无菌缓冲液。
提供的材料
ƒmagnisort™阴选抗体混合液，200次实验，20μl/次试验。2-8°c贮存。
ƒmagnisort™阴性分选磁珠，4ml。2-8°c贮存。
所需其他材料
ƒ细胞分选推荐使用的缓冲液：pbs或添加3%fbs和10mmedta的hbss。2-8°c贮存。
ƒmagnisort™磁座，5ml
ƒ12 x 75 mm流式管(5 ml, bd falcon™,货号352008或类似产品)
实验步骤
1.用适当的细胞分离液，制备浓度为1x107细胞/100μl（1 x 108/ml）的单细胞悬液。
注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。
2.将所需数量的细胞（不能超过2 x 108个细胞）放入12 x 75 mm的5ml试管中。
3.每100μl细胞中加入20μlmagnisort™阴选抗体混合液。涡旋5次混匀。室温孵育10分钟。
4.用细胞分离液洗涤细胞，使其总体积达到4ml，300xg离心5分钟。
5.弃上清，然后用细胞分离液重悬细胞至最初的体积。
注：细胞必须制成单细胞悬液。实验前需要检查样本，必要时用涡旋法或移液器去除细胞团块。
6.向每100μl细胞中加入20μl magnisort™阴性分选磁珠。涡旋5次混匀。室温孵育5分钟。
注：为确保最佳性能，将magnisort™阴性分选磁珠加入细胞之前必须充分混匀。将设定为1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打5次，重悬磁珠，不能涡旋。
7.用细胞分离液将体积加至2.5ml。将设定为1ml的pipetman™p1000移液器上下吹打3次，使其混匀。不能涡旋。
8.将试管插入磁座中间的孔底，室温孵育5分钟。
9.拿起磁座以连续的动作将试管内的上清液倒入一支新的12x75mm 5ml试管中并将磁座内的试管倒置1秒钟，然后回正。
注：切勿吸干或摇晃倒置后的试管，否则会降低未结合细胞的纯度。
10.将磁座中的试管丢弃。
11.此时，新5ml 12 x 75 mm试管中的阴性细胞即为分选后的目的细胞，备用。
相关产品列表
货号
品名
规格
mag-4902-10
magnisort™ 磁铁
5 ml
8802-6833-74
magnisort™ 人 cd19+ 阳性选择试剂盒
200 tests
msnb-6002-71
magnisort™ streptavidin negative selection beads
25 tests
msnb-6002-74
magnisort™ streptavidin negative selection beads
200 tests
8804-6810-74
magnisort™ human t cell enrichment kit
200 tests
8802-6831-74
magnisort™ 人 cd4 t 细胞 2-step富集试剂盒
200 tests
8804-6867-74
magnisort™ human b cell enrichment kit (2nd generation)
200 tests
mspb-6003-71
magnisort™ streptavidin positive selection beads
25 tests
mspb-6003-74
magnisort™ streptavidin positive selection beads
200 tests
8804-6829-74
magnisort™ 小鼠造血谱系去除试剂盒
200 tests
8804-6821-74
magnisort™ 小鼠 cd4 t 细胞富集试剂盒
200 tests
8804-6837-74
magnisort™ human pan-monocyte enrichment kit
200 tests
8802-6861-74
magnisort™ mouse cd11c positive selection kit
200 tests
8802-6842-74
magnisort™ mouse cd8 positive selection kit
200 tests
8802-6841-74
magnisort™ mouse cd4 positive selection kit
200 tests
8802-6832-74
magnisort™ human cd8 positive selection kit
200 tests
8804-6820-74
magnisort™ mouse t cell enrichment kit
200 tests
8802-6849-74
magnisort™ mouse cd45.2 positive selection kit
200 tests
8802-6848-74
magnisort™ mouse cd45.1 positive selection kit
200 tests
8802-6863-74
magnisort™ mouse f4/80 positive selection kit
200 tests
8802-6817-74
magnisort™ mouse cd335 (nkp46) positive selection kit
200 tests
8804-6816-74
magnisort™ human cd8 naïve t cell enrichment kit
200 tests
8804-6815-74
magnisort™ human cd8 memory t cell enrichment kit
200 tests
8804-6864-74
magnisort™ 小鼠 cd45 去除试剂盒（常卖）
200 tests
8804-6827-74
magnisort™ 小鼠 b 细胞富集试剂盒（常卖）
200 tests
8804-6828-74
magnisort™ 小鼠 nk 细胞富集试剂盒
200 tests
8804-6819-74
magnisort™人 nk 细胞富集试剂盒集
200 tests
8804-6802-74
magnisort™ human cd45 depletion kit
200 tests
8804-6822-74
magnisort™ 小鼠 cd8 t 细胞富集试剂盒（常卖）
200 tests
8804-6836-74
magnisort™ human hematopoietic lineage depletion kit
200 tests
8802-6860-74
magnisort™ mouse cd11b positive selection kit
200 tests
8802-6840-74
magnisort™ mouse cd3 positive selection kit
200 tests
8802-6830-74
magnisort™ human cd3 positive selection kit
200 tests
8802-6835-74
magnisort™ human cd56 positive selection kit
200 tests
8802-6847-74
magnisort™ mouse cd19 positive selection kit
200 tests
8802-6865-74
magnisort™ mouse cd45 positive selection kit
200 tests
8802-6834-74
magnisort™ human cd14 positive selection kit
200 tests
8802-6862-74
magnisort™ mouse cd49b positive selection kit
200 tests
8804-6824-74
magnisort™ 小鼠 cd4 初始 t 细胞富集试剂盒
200 tests
8804-6825-74
magnisort™ 小鼠 cd8初始 t 细胞富集试剂盒（常卖）
200 tests
8802-6843-74
magnisort™ mouse cd90.1 positive selection kit
200 tests
8802-6844-74
magnisort™ mouse cd90.2 positive selection kit
200 tests
8804-6812-74
magnisort™ human cd8 t cell enrichment kit
200 tests
8804-6811-74
magnisort™ human cd4 t cell enrichment kit
200 tests
8802-6846-74
magnisort™ mouse cd45r (b220) positive selection kit
200 tests
8804-6814-74
magnisort™ human cd4 naïve t cell enrichment kit
200 tests
8804-6813-74
magnisort™ human cd4 memory t cell enrichment kit
200 tests
8802-6838-74
magnisort™ mouse cd117 (c-kit) positive selection kit
200 tests
8802-6870-74
magnisort™ human cd117 (c-kit) positive selection kit
200 tests
关键词：流式细胞仪 显示器 防腐剂 超净工作台 移液器